Farmaceutický obzor

Najstarší farmaceutický časopis na Slovensku

  • Zväčšiť veľkosť písma
  • Predvolená veľkosť písma
  • Zmenšiť veľkosť písma
Home Farmaceutický obzor 2010 9/2010 HPLC stanovenie umbeliferónu, 4-metylumbeliferónu a skoparónu

HPLC stanovenie umbeliferónu, 4-metylumbeliferónu a skoparónu

E-mail Tlačiť PDF
  • J. Čižmárik, K. Hroboňová, J. Lehotay, Ľ. Spišská
  • Štúdium chemického zloženia propolisu VI
  • HPLC stanovenie umbeliferónu, 4-metylumbeliferónu a skoparónu
  • Farm Obz, 79, 2010, 9, s. 243-246

Na separáciu a stanovenie derivátov kumarínu a iných látok v etanolickom extrakte propolisu zo Sloven­ska sa použila HPLC metóda s C18 kolónou a on-line spektrofotometrickou a fluorescenčnou detekciou a gradientovou elúciou.

V testovaných vzorkách propolisu sa prvýkrát zistila prítomnosť kumarínov: umbeliferónu, 4-metyl­umbeliferónu a skoparónu. Koncentrácia kumarínov vo vzorkách nebola významne rozdielna v závislosti od zdroja propolisu a bola pri umbeliferóne od 0,1 do 1,2 µg.g-1, pri 4-metylumbeliferóne od 0,1 do1,7 µg.g-1 a pri skoparóne od 5,7 do 7,8 µg.g-1.

Kľúčové slová: propolis – HPLC – umbeliferón – 4-metylumbeliferón – skoparón.


V rámci systematického štúdia chemického zloženia propolisu sme na našich pracoviskách v tomto včelom produkte stanovili kyselinu 3,4-dihydroxyškoricovú (kyselina kávová) (1), kyselinu 3-hydroxy-4-metoxy­škoricovú (kyselina ferulová) (2), kyselinu dehydro­abietovú (3, 4), kyselinu p-hydroxybenzoovú, kyselinu šikimovú a kyselinu chinovú (5), kyselinu chlorogéno­vú a kyselinu rozmarínovú (6).

Sledovanie biogenézy a reaktivity týchto látok ukázalo, že v zdrojoch propolisu sa môžu nachádzať i ďalšie deriváty ich biogenézy, medzi ktoré patria i kumaríny.

V tejto časti práce sme sa preto zamerali na HPLC stanovenie niektorých kumarínov.

Zo skupiny kumarínov bol roku 1977 v propolise opísaný eskuletín a skopoletín (7) a kolektív autorov Nagy, Suchý, Uhrín, Ubík a Grančai opísal eskuletín, dafnetín a 5-metyléterchryzén (8).

Experimentálna časť

Chemikálie

Acetonitril a etanol pre gradientovú HPLC (Merck), kyselina octová pre analýzu (Merck), deriváty kuma­rínu (Sigma Aldrich).

Vzorky propolisu sa zbierali z úľa pred zimným obdobím a pred spracovaním sa uskladňovali v suchých podmienkach a v tme. Vzorky sa získali z oblasti západného a východného Slovenska z obdobia rokov 2005 – 2009.

Príprava etanolického extraktu

I. a II. etanolický extrakt (západ SR, 2004 (I), 2009 (II)): vzorka propolisu (150 g) sa extrahovala 500 ml etanolu pri laboratórnej teplote po dobu troch dní. Následne sa roztok centrifugoval (1000 g, 10 min).

III. etanolický extrakt (východ SR, 2005): vzorka propolisu (250 g) sa extrahovala 500 ml etanolu pri laboratórnej teplote po dobu troch dní. Následne sa roztok prefiltroval.

Chromatografická analýza

Na HPLC analýzu sa použil kvapalinový chro­matograf serie HP 1100 pozostávajúci z vysokotlako­vého čerpadla, dávkovacieho ventilu Rheodine, termostatu kolóny, detektora s diódovým poľom a fluorescenčného detektora.

Analýza kumarínov sa uskutočnila na chro­matografickej kolóne typu LichroSpher 100 RP-18 (250 x 4,6 mm I.D., 5 µm) spojenej s ochrannou predkolónou (30x3.9 I.D., 5 µm) toho istého typu. Mobilnou fázou bola zmes acetonitril 0,3 % kyselina octová (A) a acetonitril (B) s gradientovou elúciou (0 – 35 min 0 – 56 % B, 35 – 40 min 56 – 100 % B, 40 – 45 min 100 % B, 45 – 47 min 100 – 0 % B). Prietok mobilnej fázy bol 0.5 ml.min-1, dávkovaný objem 20 µl a teplota kolóny 22 °C.

Na detekciu sa použil spektrofotometrický detektor (pre 4-hydroxykumarín, skoparón, kumarín a ško­ricylalkohol, chromatogramy sa snímali pri vlnovej dĺžke 280 nm), pre eskulín, dafnetín, fraxetín, umbeliferón, 4-metylumbeliferón a herniarín sa chromatogramy snímali pri vlnovej dĺžke 323 nm), ktorý bol on-line spojený s fluorescenčným detektorom na detekciu eskulínu, umbeliferónu, 4-metyl-umbe­liferónu, skoparónu a herniarínu (excitačná vlnová dĺžka 320 nm a emisná vlnová dĺžka 450 nm).

Výsledky a diskusia

Kumaríny majú bohaté zastúpenie v rastlinnej ríši. Obsahom kumarínu je známa najmä „marinka“ (lipkavec marinkový), kde vzniká pri sušení. Inými zdrojmi sú komonica, mrkvovité a rutovité rastliny. Kumaríny tvoria pomerne veľkú skupinu látok s rôznymi farmakologickými účinkami a vyznačujú sa príjemnou vôňou. Pôsobia tlmivo na centrálnu nervovú sústavu, majú antipyretický a spazmolytický účinok (9). Skupina skúmaných analytov bola zvolená na základe predpokladaných rastlinných zdrojov dostup­ných na Slovensku. Chemické štruktúry študovaných kumarínov sú na obrázku 1.

Cieľom práce bolo vypracovať metódu vysokoúčin­nej kvapalinovej chromatografie na stanovenie vybra­nej skupiny obsahových látok v propolise. Prvým krokom HPLC analýzy bolo vybrať vhodné chromatografické podmienky, t. j. stacionárnu fázu, mobilnú fázu, spôsob detekcie a určiť elučné charakteristiky. Na separáciu celej skupiny látok sa testoval systém z obrátenými fázami, a to kolóny typu C18 s izokratickou alebo gradientovou elúciou mobil­nou fázou acetonitril – 0,3 % kyselina octová. Ako najvhodnejšia detekcia sa zvolila spektrofotometrická detekčná metóda, keďže skúmané látky absorbujú v UV oblasti. Na dosiahnutie vyššej citlivosti pre niektoré kumaríny sme použili fluorescenčnú detekčnú metódu. Hodnoty absorpčných maxím študovaných kumarínov sa nachádzajú v rozsahu od 220 do 335 nm. Pre skupinu látok eskulín, dafnetín, umbeliferón, 4-metylumbeliferón, herniarín sa na detekciu použila vlnová dĺžka 323 nm. Pre látky 4-hydroxykumarín, kumarín a skoparón bola citlivejšia vlnová dĺžka 280 nm. Z merania flourescenčných spektier sa zistila vhodná excitačná a emisná vlnová dĺžka pre fluores­cenčnú detekciu (?excit = 320 nm, ?em = 450 nm). Flourescenčná detekcia bola vhodná pre látky umbe­liferón, 4-metylumbeliferón, skoparón a herniarín. Elučné charakteristiky a rozlišovacie faktory študo­vaných látok použitím vhodných chromatografických a detekčných podmienok sú uvedené v tabuľke 1. Celkový čas analýzy bol 30 min.

Pre študované analyty bola odozva spektro­foto­metric­kého detektora linerná (r = 0,998) v rozsahu koncentrácií 1 – 1000 µg.ml-1 a fluorescenčného detektora (r = 0,999) v rozsahu koncentrácií 1 – 1000 ng.ml-1. Pre spektro­fotometickú detekciu sa dosiahli medze detekcie od 0,2 do 0,75 µg.ml-1 a medze stanoviteľnosti od 0,5 do 1,0 µg.ml-1. Pre fluorescenčnú detekciu sa dosiahli medze detekcie od 0,1 do 5,0 ng.ml-1 a medze stanoviteľnosti od 0,5 do 10 ng.ml-1. Hodnoty medzi detekcie (LOD) a medzi stanoviteľnosti (LOQ) sú uvedené v tabuľke 1.

Navrhnuté podmienky separácie a detekcie pre zvolenú skupinu derivátov kumarínu boli použité na analýzu vzoriek etanolického extraktu propolisu. Na detekciu bola použitá spektrofotometrická a fluo­res­cenčná detekcia v on-line spojení. Z chromatografic­kých záznamov testovaných vzoriek sa na základe porovnania retenčných faktorov, porovnania UV spektier a fluorescenčných signálov ukazuje, že v testovaných vzorkách sa nachádza umbeliferón, 4-metylumbeliferón a skoparón. Koncentrácie týchto látok sa zistili metódou kalibračnej krivky a sú uvede­né v tabuľke 2. Zo zistených výsledkov vyplýva, že koncentrácia skoparínu sa výrazne nemení v závislosti od lokality zberu. Vo vzorke propolisu z východného Slovenska koncentrácia umbeliferónu bola nižšia v porovnaní s koncentráciou vo vzorkách zo západ­ného Slovenska. Koncentrácia 4-metylumbeliferónu v propolise z východného Slovenska bola pod medzou detekcie. Na obrázku 2 a 3 sú uvedené chromatografic­ké záznamy zmesi referenčných látok a extraktu vzoriek propolisu získané použitím spektro­foto­metric­kej a fluorescenčnej detekcie.

Táto práca vznikla za podpory grantu č. 1/0058/08 Vedeckej grantovej agentúry Ministerstva školstva SR a Slovenskej akadémie vied.

Literatúra

1.     Čižmárik, J., Matel, I.: Examination of the chemical composition of propolis I. Isolation and identification of the 3,4-dihydroxycinnamic acid (caffeic acid) from propolis. Experientia, 26, 1970, s. 713.
2.    Čižmárik, J., Matel, I.: Examination of the chemical composition of propolis II. Isolation and identification of 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid (ferulic acid) from propolis. J. Apic. Res., 12 (1), 1973, s. 52 – 54 .
3.     Čižmárik, J., HROBOŇOVÁ, K., LEHOTAY, J.: Examination of the chemical composition of propolis III. Identification of dehydroabietic acid and abietic acid in propolis. Sci. Pharm. Suppl., 1/74, 2006, s. 42.
4.     HROBOŇOVÁ, K., LEHOTAY, J., Čižmárik, J., SKAČÁNI, I.: HPLC determination and MS identification of dehydroabietic and abietic acid in propolis. J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol., 28, 2005, s. 1725 – 1735.
5.     Čižmárik, J., HROBOŇOVÁ, K., LEHOTAY, J., ŠIMKOVÁ, D.: Štúdium chemického zloženia propolisu IV. Analýza vodného extraktu propolisu. Farm. Obzor, 75, 2006, s. 284 – 288.
6.     Čižmárik, J., HROBOŇOVÁ, K., LEHOTAY, J.: Examination of the chemical composition of propolis V. HPLC analýza organických kyselín. Farm. Obzor, 75, 2006, s. 289 – 292.
7.     TICHONOV, A.I., DRANÍK, I.L., LITVINENKO, V.I.: Components of a water-soluble polyphenol preparation from propolis. J. Chim. Prirod. Soedin., 13, 1977, s. 416 – 417.
8.     NAGY, M., SUCHÝ, V., UHRÍN, D., UBIK, K., BUDEŠINSKÝ, M., GRANČAI, D.: Constituents of propolis of Czechoslovak origin, V. Chem. Papers, 1988, 42 (5), s. 691 – 696.
9.     KRESÁNEK, J., ml., KRESÁNEK, J., st.: Atlas liečivých rastlín a lesných plodov. Martin: Osveta, 2008, s. 25.

J. ČIŽMÁRIK, K. HROBOŇOVÁ, J. LEHOTAY, Ľ. SPIŠSKÁ
Katedra farmaceutickej chémie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava
Ústav analytickej chémie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU

 

SUMMARY

J. Čižmárik, K. Hroboňová, J. Lehotay, Ľ. Spišská

DETERMINATION OF THE CHEMICAL COMPOSITION OF PROPOLIS VI.HPLC DETERINATION OF UMBELIPHERON, 4-METHYLUMBELIPHERON AND SCOPARON

In the present study, HPLC methods on C18 column with on-line spectrophotometric and fluorimetric detection and gradient elution was used for separation and determination coumarins and other compounds in ethanol extracts of propolis samples from Slovakia.  On the base of HPLC analysis the umbelipheron, 4-methylumbelipheron and scoparon were identified in tested samples of propolis. The content of coumarin in samples was not significant depending on the source of propolis. The content of umbelipheron varied from 0,1 to 1,2 µg.g-1, 4-methylumbelipheron from 0,1 to 1,7 µg.g-1and scoparon from 5,7 to 7,8 µg.g-1.
Key words: propolis – HPLC – umbelipheron – 4-umbelipheron – scoparon.

 

Reklamný prúžok
Reklamný prúžok
Reklamný prúžok
Reklamný prúžok

Partneri