• S. Dokupilová, M. Hutta
• Analýza a špeciácia selénu v potravinových vzorkách a doplnkoch metódami kvapalinovej chromatografie
• Farm Obz, 79, 2010, 9, s. 253-259

Selén je stopový prvok, ktorý má dôležitú úlohu pri ochrane zdravia človeka a ktorý sa do tela dostáva prostredníctvom potravín. V prípade nedostatočného prirodzeného výskytu v potravinách možno zvýšiť jeho prísun do organizmu prostredníctvom výživových doplnkov. V týchto sa selén nachádza v anorganic­kej forme ako SeIV – seleničitany a SeVI – selenany, prípadne v organickej forme, získavaný z extraktov rastlín alebo selenizovaných kvasníc. Narastajúci záujem o selenizované potraviny a výživové doplnky vedie k potrebe spoľahlivých validovaných analytických metód pre identifikáciu a kvantifikáciu rôznych zlúčenín selénu – špeciácii. Táto práca prináša prehľad prác, ktoré sa zaoberajú špeciáciou selénu pomocou kvapalinovej chromatografie vo vzorkách kvasníc, prípadne iných rastlín a prehľad extrakčných metód z matrice kvasníc, ktoré sú nevyhnutné vzhľadom na zložitú matricu a nevyhnutnú úpravu vzorky pred analýzou.

Kľúčové slová: selén, špeciácia, kvapalinová chromatografia, výživové doplnky.

Selén je stopový prvok, ktorý má vo veľmi úzkom koncentračnom intervale pozitívne účinky na človeka a zároveň je toxický pri nadmernom užití. V pôde sa nachádza vo forme anorganických solí (najmä v oxidačných stupňoch SeIV – seleničitany a SeVI – selenany), ktoré rastliny dokážu premeniť na organické zlúčeniny. Selén je zabudovávaný do tkanív, kde nahrádza atóm síry v aminokyselinách (1). Medzi najvýznamnejšie sledované formy selénu patria už spomínané anorganické zlúčeniny a organické zlú­čeniny, ako metylselenol, dimetylselenid, dietylselenid, aminokyseliny (napr. selenometionín, selenocysteín, selenocystín, selenometyl-selenocystín, seleno-propyl-selenocysteín), proteíny a enzýmy obsahujúce selén (2). Selén v organickej forme je pre ľudí aj pre zvieratá výrazne biologicky dostupnejší ako anorganické formy.

Selén v ľudskom organizme pôsobí ako silný antioxidant. Chráni bunky pred poškodením voľnými radikálmi. Je súčasťou endogénneho antioxidačného enzýmu GSH – px (glutatiónperoxidázy). Potlačením aktivity voľných radikálov selén prispieva k zníženiu bolesti kĺbov, zlepšuje kvalitu vlasov, nechtov aj pleti. Má významnú funkciu pri tvorbe trijódtyronínu z ty­roxínu v štítnej žľaze. Je súčasťou enzýmu jodotyronín­dejodináza, ktorý premieňa neaktívne prekurzory na aktívny tyreoidový hormón trijódtyronín (3). Selén zvyšuje funkciu imunitného systému a odolnosť orga­nizmu proti vírusovým a baktériovým ochoreniam. Uplatňuje sa v prevencii aterosklerózy a bráni poško­deniu myokardu. Ateroskleróza ako jedno z najčastej­ších kardiovaskulárnych ochorení je sprevádzaná tvorbou ateromatóznych plátov v cievnej stene. Ich uvoľnenie do cirkulácie môže vyústiť do trombózy. Je dokázané, že nedostatok selénu zvyšuje riziko trombó­zy až štvornásobne. Krajiny s nízkym obsahom selénu v poľnohospodárskej pôde majú zároveň najvyšší výskyt kardiovaskulárnych ochorení. Preto niektoré krajiny obohacujú hnojivá o selén, aby kompenzovali jeho extrémne nízky obsah v pôde. Zlúčeniny selénu viažu ťažké kovy (Cd, Hg, Pb) a redukujú ich negatív­ny vplyv na organizmus. Dánsky výskum poukázal na vysoké hodnoty ortuti (viac ako 700 % normálnych hodnôt) u Eskimákov z Grónska z dôvodu konzumácie kontaminovaných rýb. Zároveň však vysoký obsah selénu v rybách spôsobil, že s ortuťou vytvoril málo toxickú zlúčeninu (4). Selén spomaľuje starnutie, podporuje plodnosť u mužov zlepšením pohyblivosti spermií. Selén je kofaktorom enzýmu PHG – px (fos­fo­lipidohydroperoxidglutatiónperoxidázy), ktorý zabez­pe­čuje životaschopnosť spermií. Mnohé štúdie nazna­čujú, že selén by mohol významne prispievať k pre­vencii vzniku rakoviny. Pri podávaní selenizovaných kvasníc sa zaznamenal pokles úmrtnosti ľudí spôsobený rakovinou priemerne o 50 % (5). Významný prínos v sledovaní úlohy selénu v prevencii rakoviny má mať prebiehajúca rozsiahla štúdia PRECISE (Prevention of Cancer through Intervention with Selenium – Preven­cia rakoviny pomocou selénu). Je to osemročná placebom kontrolovaná štúdia uskutočnovaná na 42 000 zdravých Európanoch. Jej úlohou je priniesť informácie, ako suplementácia selénu ovplyvní výskyt rakoviny a úmrtnosť.

Pri nadmernom príjme selénu (nad 1000 ?g denne) sa prejavujú aj jeho toxické vlastnosti. Môžu sa prejaviť ako zápal dýchacích ciest, edém pľúc, krvácavosť, kožné zmeny a depresie. Typickým príznakom je naj­mä tzv. cesnakový dych spôsobený metabolitom dimetyldiselenidom a kovová chuť v ústach. Vo vážnych prípadoch sa objavuje cirhóza pečene a žlté sfarbenie kože a slizníc, vypadávanie vlasov až zlyha­nie obličiek (6). Niektoré štúdie poukazujú na to, že dlhodobo vysoká hladina selénu v organizme môže mať mutagénne, teratogénne a kancerogénne účinky.

Množstvo selénu v ľudskom organizme závisí od jeho príjmu v potrave. Odporučená denná dávka podľa Svetovej zdravotníckej organizácie je 50 – 200 ?g. Najvyšší obsah selénu je v cereáliách, orieškoch, rastlinách rodu Brassica a Allium (brokolica, karfiol, ružičkový kel, cibuľa, cesnak a pod.). Vedecky zaujímavým zdrojom selénu je rastlina Lecythis ollaria, ktorej orechy obsahujú vysoké množstvá selénu (7).

Selén vo výživových doplnkoch

Na zvýšenie príjmu selénu okrem selénom obo­hatených potravín možno využiť výživové doplnky. V nich sa selén nachádza vo forme anorganickej ako SeIV – seleničitany a SeVI – selenany, alebo vo viazanej organickej forme. Získavaný je z extraktov rastlín, vačšinou ale vo forme selenizovaných kvasníc Saccharomyces cerevisae.

Pre čo najvyššiu biologickú dostupnosť boli vyvinuté pre štúdiu PRECISE špeciálne štandardizované kvas­nice so selénom – tzv. SelenoPrecise, ktoré sú dostupné aj na slovenskom trhu.

Všetky uvedené fakty jasne naznačujú potrebu analýzy a špeciácie foriem selénu v rôznorodých a často aj veľmi komplikovaných matriciach. Pred analytickou chémiou tak stoja nové výzvy špeciácie stopových koncentrácií selénu, čo sa nezaobíde bez využitia selektívnych separačných metód a selektív­nych a citlivých detekčných metód.

Vzhľadom na snahu nájsť čo najúčinnejšie formy selénu, ktoré by bolo možné využiť vo výživových doplnkoch, neustále sa vyvíjajú separačné metódy, ktoré umožnia špeciáciu selénu v mnohozložkových biologických matriciach, a tak dopomôžu objasniť účinky selénu na ľudský organizmus.

Najčastejšie uvádzanou separačnou metódou je vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Viacerí autori uvádzajú, že v kvasniciach obohatených selénom sa selén nachádza viazaný prevažne v amino­kyseline selenometionín (8, 9, 10). Pred stanovením aminokyselín vo vzorkách kvasníc je potrebné najskôr ich rozložiť, a tak viazaný selén uvoľniť. Prístupy autorov sú rôzne. Najčastejšie sa uplatňuje enzymatic­ký rozklad (9, 11 – 14). Niektorí autori využili na extrakciu deionizovanú vodu (8, 11, 15), prípadne ultrazvuk (16, 17). Prehľad je v tabuľke 1.

Vzhľadom na rozdiely vo výsledkoch získaných spomínanými extrakčnými postupmi sa porovnaniu štrnástich extrakčných metód venovali autori práce (18) na modelovej vzorke 0,1 g kvasníc obohatených selenometionínom a metionínom, kde sledovali extrakciu uvedených aminokyselín. Za najvhodnejšiu metódu vybrali extrakciu pomocou kyseliny metán­sulfónovej. Prehľad výsledkov je v tabuľke 2.

Separácii extrahovaných zlúčenín selénu je veno­vaných mnoho prác v odborných časopisoch. V tabuľ­ke 3 uvádzame prehľad vybraných prác venovaných špeciácii selénu v rôznych matriciach metódou HPLC. Porovnaniu iónovo-párovej chromatografie, iónovo-výmennej chromatografie a chromatografie na obrá­tených fázach sa venuje práca autorov (8). Ako výhodu iónovo-výmennej chromatografie hodnotia dobrú se­paráciu seleničitanov a selenanov, ale horšie rozlíšenie ostatných zlúčenín selénu. Výhodou chromatografie na obrátených fázach s predkolónovou derivatizáciou je dobrá selektivita aminozlúčenín selénu. Najlepšia separácia bola dosiahnutá iónovo-párovou chro­matografiou, čo naznačujú aj práce mnohých iných autorov.

Táto práca poukazuje na vysoký záujem o vytvorenie spoľahlivých analytických postupov, ktoré by pomocou účinných extrakčných, frakcionačných, separačných a selektívnych detekčných metód pomohli k charakterizácii možných zdrojov biologicky účinnej formy selénu, a tak zvýšili jeho príjem obyvateľstvom na potrebnú úroveň.*

*Práca je súčasťou výskumného programu podporovaného grantovou agentúrou MŠ SR VEGA 1/0003/08.

Zoznam skratiek

• AAS        atómová absorpčná spektrometria
• AED        atómová emisná detekcia
• AFS        atómová fluorescenčná spektrometria
• ET        elektrotermická
• FAAS        plameňová atómová absorpčná spektrometria
• GC        plynová chromatografia
• HFBA        heptafluorobutánová kyselina
• HG        hydridová generácia
• HPLC        vysokoúčinná kvapalinová chromatografia
• ICP        iónovo-viazaná plazma
• LC        kvapalinová chromatografia
• MS        hmotnostná spektrometria
• MW        mikrovlnný
• N2MIP    dusík-mikrovlnne indikovaná plazma
• RP        obrátené fázy
• TFA        trifluorooctová kyselina
• UV        ultrafialový

LITERATÚRA

1.    CHÉRY, C. C., DUMONT, E., CORNELIS, R., MOENS, L.: Detection and quantification of selenium in proteins by means of gel electrophoresis and electrothermal vaporization ICP-MS. Fresenius‘ J. Anal. Chem., 371, 2001, s. 775 – 781.
2.    PYRZYNSKA, K.: Selenium speciation in enriched vegetables. Food Chem., 114, 2009, s. 1183 – 1191.
3.    EL-Bayoumy, K., Rao, C.V., Reddy, S.B.: Multiorgan sensitivity to anticarcinogenessis by the organoselenium 1,4-phenylenebis (methylene) selenocyanate. Nutr. Cancer, 40, 2001, č. 1, s. 18 – 27.
4.    MAINZ, J., MADSEN, B.F.: Selen – nezbytná složka výživy pro vaše zdraví. Schweitzer, Larsen og Knudsen, Forlaget Ny Videnskab, 2000, s. 32.
5.    Clark, l.c., Turnball, b.w., Slate, e.h., Chalker, d.k., Chow, j., Davis, l.s. et al.: Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin. A randomized controlled trial. Nutritional Prevention ofCancer Study Group. J. Am. Med. Ass., 276 , 1996,s. 1957 – 1963.
6.    http://www.vup.sk/index.php?start&mainID=3&navID=42 (august 2010)
7.    HAMMEL, C., KYRIAKOPOULOS, A., BEHNE, D., GAWLIK, D., BRATTER, P.: Protein-bound selenium in the seeds of coco de mono (Lecythis ollaria). J. Trace Elem. Med. Biol., 276, 1996, s. 96 – 102.
8.    BIRD, S.M., GE, H., UDEN, P.C., TYSON, J. F., BLOCK, E.: .J Chromatogr. A, 789, 1997, s. 349 – 359.
9.    AMAOKO, P.O., UDEN, P.C., TYSON, J.F.: Speciation of selenium dietary supplements; formation of S-(methyl­seleno)cysteine and other selenium compounds. Anal. Chim. Acta, 652, 2009, s. 315 – 323.
10.    KORHOLA, M., VAINIO, A., EDELMANN, K.: Selenium yeast. Ann. Clin. Res., 18, 1986, s. 65 – 68.
11.    DUMONT, E., DE CREMER, K., VAN HULLE, M., CHÉRY, C.C., VANHAECKE, F., CORNELIS, R.: Separation and detection of Se-compounds by ion pairing liquid chromatography-microwave assisted hydride generation-atomic fluorescence spectrometry. J. Anal. At. Spectrom, 19, 2004, s. 167 – 171.
12.    KOTREBAI, M., TYSON, J.F., BLOCK, E., UDEN, P.C.: High-performance liquid chromatography of selenium compounds utilizing perfluorinated carboxylic acid ion-pairing agents and inductively coupled plasma and electrospray ionization mass spectrometric detection.J. Chromatog.r A, 866, 2000, s. 51 – 63.
13.    KAHAKACHCHI, CH., BOAKYE, H.T., UDEN, P.C., TYSON J.F.: Chromatographic speciation of anionic and natural selenium compounds in SE- accumulatingBrassica juncea (Indian mustard) and in selenized yeast. J. Chromatogr. A, 1054, 2004, s. 303 – 312.
14.    ENCINAR, J.R., SLIWKA-KASZYNSKA, M., POLATAJKO, A., VACCHINA, V., SZPUNAR, J.: Methodological advances for selenium speciation analysis in yeast. Anal. Chim. Acta, 500, 2003, s. 171 – 183.
15.    LIANG, L., MO, S., ZHANG, P., CAI, Y., MOU, S., JIANG, G., WEN, M.: Selenium speciation by high-performance anion-exchange chromatography – post-column UV irradiation coupled with atomic fluorescence spectro­metry. J. Chromatogr. A, 1118, 2006, s. 139 – 143.
16.    FAR, J., PREUD‘HOMME, H., LOBINSKI, R.: Detection and identification of hydrophilic selenium compounds in selenium-rich yeast by size exclusion–microbore normal-phase HPLC with the on-line ICP–MS and electrospray Q-TOF-MS detection. Anal. Chim. Acta, 657, 2010,s. 175 – 190.
17.    CHASSAIGNE, H., CHÉRY, C.C., BORDIN, G., RODRIGUEZ, A.R.: Development of new analytical methods for selenium speciation in selenium-enriched yeast material. J. Chromatogr. A, 976, 2002, s. 409 – 422.
18.    YANG, L., STUGERON, R.E., MCSHEEHY, S., MESTER, Z.: Comparison of extraction methods for quantitation of methionine and selenomethionine in yeast by species specific isotope dilution gas chromatography–mass spectrometry. J. Chromatogr. A., 1055, 2004,s. 177 – 184.
19.    Wróbel, K., Wróbel, K., Kannamkumarath, S.S., Caruso, J.A., Wysocka, I.A., Bulska, E., SWIATEK, J., WIERZBICKA, M.: HPLC-ICP-MS speciation of selenium in enriched onion leaves- a potential dietary source of Se-methylselenocysteine. Food Chem., 86, 2004, s. 617 – 623.
20.    BIERLA, K., SZPURNA, J., LOBINSKI, R.: Specific determination of selenoaminoacids in whole milk by 2 D size-exclusion-ion-paring reversed phase high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP MS). Anal. Chim. Acta, 624, 2008, s. 195 – 202.
21.    CHEN, H., GAO, Y., LI X., HOU, X., LV, Y.: A novel HPLC-UV/nano-TiO2-chemiluminescence system for the determination of selenocystine and selenomethionine.J. Chromatogr. B, 870, 2008, s. 216 – 221.
22.    MAZEJ, D., OSVALD, J., STIBILJ, V.: Selenium species in leaves in leaves of chicory, dandelion lamb’s lettuce and parsley. Food Chem., 107, 2008, s. 75 – 83.
23.    CANKUR, O., YATHAVAKOLLA, S.K.V., CARUSO, J.A.: Selenium speciation in dill (Anethum graveolens L.)by ion paring reversed phase and cation exchangeHPLC with ICP-MS detection. Talanta, 70, 2006,s. 784 – 790.
24.    MAZEJ, D., FALNOGA, I., VEBER, M., STIBILJ, V.: Determination of selenium species in plant leaves by HPLC-UV-HG-AFS. Talanta, 68, 2006, s. 558 – 568.
25.    GERGELY, V., KUBACHKA, K.M., MOUNICOU, S.: Selenium speciation in Agaricus bisporus and Lentinula edodes mushroom proteins using multi-dimensional chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1101, 2006,s. 94 – 102.
26.    CHATTERJEE, A., SHIBATA, Y., TAO, H., TANAKA, A., MORITA, M.: High-performance liquid chromatography-ultrasonic nebulizer high-power nitrogen microwave-induced plasma mass spectrometry, real-time on-line coupling for selenium speciation analysis. J. Chromatogr. A, 1042, 2004, s. 99 – 106.
27.    AUGER, J., YANG, W., ARNAULT, I., PANNIER, F., POTIN-GAUTIER, M.: High-performance liquid chromatographic-inductively coupled plasma mass spectrometric evidence for Se-„alliins“ in garlic and onion grown in Se-rich soil. J. Chromatogr. A, 1032, 2004, s. 103 –107.
28.    CHATTERJEE, A., SHIBATA, Y., MORITA, M.: Determination of selenomethionine by high performance liquid chromatography-direct hydride generation-atomic absorption spectrometry. Microchem. J., 69, 2001,s. 179 – 187.
29.    IPOLYI, I., STEFÁNKA, Z., FODOR, P.: Speciation of Se(IV) and the selonoamino acids by high-performance liquid chromatography-direct hydride generation-atomic fluorescence spectrometry. Anal. Chim. Acta, 435, 2001,s. 367 – 375.
30.    STADLOBER, M., SAGER, M., IRGOLIC, K.J.: Effects of selenate supplemented fertilisation of the selenium level of cereals-identification and quantification of selenium compounds by HPLC-ICP-MS. Food Chem., 73, 2001,s. 357 – 366.
31.    LI, F., GOESSLER, W., IRGOLIC, K.J.: Determination of trimethylselenonium iodide, selenomethionine, selenious acid, and selenic acid using high-performance liquid chromatography with on-line detection by inductively coupled plasma mass spectrometry of flame atomic absorption spectrometry. J. Chromatogr. A, 830, 1999,s. 337 – 344.
32.    SHIOBARA, Y., YOSHIDA, T., SUZUKI, K.T.: Effects of dietary selenium species on Se concentrations in hair, blood, and urine. Toxicol. Appl. Pharmcol., 152, 1998,s. 309 – 314.
33.    YATHAVAKILLA, S.V.K., SHAH, M., MOUNICOU, S., CARUSO, J.A.: Speciation of cationic seleniumcompounds in Brassica Juncea leaves by strong cation-exchange chromatography with inductively coupledplasma mass spectrometry. J.Chromatog.r A, 1100, 2005,s. 153 – 157.
34.    KÁPOLNA, E., SHAH, M., CARUSO, J., FODOR, P.: Selenium speciation studies in Se-enriched chives (Allium schoenoprasum) by HPLC-ICP-MS. Food Chem., 101, 2007, s. 1398 – 1406.
35.    MONTES- BAYÓN, M., MOLET, M.J.D., GONZÁLES, E.B., SANZ-MEDEL, A.: Evaluation of different sample extraction strategies for selenium determination inselenium-enriched plant (Allium sativum and Brassica juncea) and Se speciation in HPLC-ICP-MS. Talanta, 68, 2006, s. 1287 – 1293.

S. Dokupilová, M. Hutta
Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava
Katedra analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava

Summary

S. Dokupilová, M. Hutta

Analysis and Speciation of Selenium in Food Samples and Supplements by Methods of Liquid Chromatography

Selenium is a trace element, which has an important role in man health protection, that comes to human body through food. In the case of natural defficiency in food, it is possible to increase its itake to human body by food supplements, where it occurs in inorganicform as SeIV - selennite a SeVI – selenate, or in organic form, received from plant extracts, or selenized yeast. The increasing interest in selenized food and food supplements, leads to need for reliable and validated analytical methods for identification and quantification different selenium species. This work brings the review of publications concerning selenium speciation by liquid chromatography in the yeast, and other plant samples, and review of extraction methods from yeast samples, that are necessary according to complicated matrix, and sample pre- treatment.

Key words: selenium, speciation, liquid chromatography, supplements.