• M. Obložinský, L. Bezáková
• Molekulárno-biologická charakterizácia rastlinných fosfolipáz D
• Farm Obz, 79, 2010, 6, s. 153-157

Prehľadná práca sumarizuje poznatky o molekulárno-biologickej charakterizácii rastlinných fosfolipáz D (PLD, EC 3.1.4.4). Tento enzým plní jednu z kľúčových úloh v signálne transdukčných procesoch. V ostatnom čase sa PLD stala objektom intenzívneho záujmu, a to v dôsledku štúdia úloh membránových fosfolipidov a fosfolipáz v bunkovej regulácii. V práci sa venuje pozornosť jednotlivým izoformám PLD, najmä z pohľadu ich katalytickej aktivity a substrátovej špecifity. Rozpracovaná je aj problematika molekulárnej štruktúry izoenzýmov.

Kľúčové slová: Fosfolipáza D – izoenzýmové formy – katalytická aktivita – substrátová špecifita

Aktivita fosfolipázy D (PLD, EC 3.1.4.4) bola v rastlinných pletivách preukázaná už v pätdesiatych rokoch minulého storočia (1). Jej prítomnosť bola neskôr dokázaná aj v živočíchoch, hubách a baktériách (2). Ako typický katabolický enzým (t. j. lipáza schopná degradácie fosfolipidov) však PLD nebola tak zaujíma­vá ako iné fosfolipázy, najmä fosfolipáza A2 (PLA2) a fosfolipáza C (PLC). V ostatnom čase sa PLD opäť stala objektom intenzívneho záujmu, a to v dôsledku štúdia úloh membránových fosfolipidov a fosfolipáz v bunkovej regulácii (3). Keďže substrátmi PLD sú za natívnych podmienok zložky bunkových membrán (fosfolipidy formujú základnú matrix biologickej membrány), majú tieto aktivity (najmä hydrolytická aktivita PLD) výrazný vplyv na ich zloženie, štruktúru a stabilitu. Transfosfatidylačná aktivita PLD by pritom mohla predstavovať aj potenciálny nástroj transfor­mácie fosfolipidov bunkových membrán (4).

1. Rastlinné formy PLD

Zo všetkých typov fosfolipáz sa PLD zdá byť prevládajúcim typom práve v rastlinných pletivách (5). Rastlinné PLD (tab. 1) sa rozdeľujú podľa všeobecne uznávanej klasifikácie pracovnej skupiny prof. X. Wanga (Manhattan KS, USA) do skupín: PLD?, PLD?, PLD? a PLD?. Táto pracovná skupina sa zaoberá detailným štúdium PLD v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Skríningom v génovej databanke bolo identifikovaných sedem izoenzýmov, z ktorých päť je v rastline aj skutočne exprimovaných (6, 7).

1.1. PLD?-formy

Prvá identifikovaná PLD v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. bola označená ako PLD?. Sekvenčné porov­nania génov iných, už osekvenovaných PLD (Ricinus communis L. (8), Oryza sativa L. a Zea mays L. (9), Brassica oleracea L. (10)), ale aj novoidentifikovaných PLD (Craterostigma plantagineum L. (11), Nicotiana tabacum L. (12)), poukazujú na ich zaradenie práve do skupiny PLD?. Všetky tieto PLD sú silne Ca2+-de­pendentné (20 – 100 mM) a majú pH optimum v kyslej oblasti (4,5 – 6,0) (13). Keďže PLD?-forma má u rastlín najvýraznejšie zastúpenie, bola izolovaná a purifiko­vaná z rôznych rastlinných zdrojov.

Pri izolácii PLD z Ricinus communis L. bolo dokonca identifikovaných niekoľko izoenzýmov PLD? (PLD?1, PLD?2, PLD?3). PLD?1 a PLD?2 sa izolovali z dvoj­dňového endospermu a PLD?3 z päťdňového endospermu. Výskyt a aktivita jednotlivých foriem PLD je pritom časovo a vývinovo špecifická. Aktivita PLD?1 a PLD?2 vrcholí v endosperme na druhý deň klíčenia a po treťom dni ju už nemožno zazname­nať. Aktivita PLD?3 sa objavuje v endosperme až na štvrtý deň klíčenia. Počas vývinu listov je aktivita PLD? vyššia v mladších ako v rozvinutých listoch. V mla­dých listoch je aktivita PLD? viazaná na cytozolovú frakciu, kým v plne rozvinutých listoch na mikrozomálnu frakciu. Mladé listy obsahujú najmä PLD?1 a PLD?2. PLD?3 sa nachádza predovšetkým v starších pletivách. Všetky tri formy majú hydro­­-lytický účinok na fosfatidylcholín (PC), fosfatidyletano­lamín (PE) a fosfatidylglycerol (PG). PLD?1 a PLD?2 hydrolyzujú PC a PG vo väčšej miere ako PE, kým PLD?3 vykazuje rovnakú aktivitu voči PC, PE a PG. Rozdiely v substrátovej špecifite jednotlivých foriem PLD sa môžu rôzne premietnuť do funkčného vzťahu k bunke. Aktivácia PLD?1 a PLD?2 môže vyústiť k selektívnej degradácii fosfolipidov, čím sa mení zlo­ženie membrány. Aktivácia PLD?3 môže viesť k celkovej degradácii membránových fosfolipidov (14).

V Catharanthus roseus (L.) G.Don bola identifikovaná špecifická forma PLD, tzv. fosfatidylinozitol (PI) – špecifická PLD. Táto PLD sa vyskytuje v dvoch izoformách, ale na rozdiel od ostatných rastlinných PLD tieto dve izoformy hydrolyticky štiepia len PI. Pri testovaní iných fosfolipidov ako substrátov (PC, PE, PG, PS) nevznikajú žiadne štiepne produkty. PLD z tohto rastlinného zdroja nevykazuje žiadnu transfosfatidylačnú aktivitu a hydrolytická aktivita je stimulovaná prítomnosťou PG. S výnimkou vysokej tepelnej stability a nepatrne nižšieho izoelektrického bodu v proteíne s menšou molekulovou hmotnosťou sú molekulárno-biologické vlastnosti izoenzýmov identické (15).

V Brassica oleracea L. sú známe dva izoenzýmy PLD (PLD?1 a PLD?2) (10). Substrátová špecifita oboch izoenzýmov je široká, od hydrolýzy rôznych fosfolipi­dov (PC, PE, PG, PS, PI, kardiolipín (CL)) (2) až po hydrolýzu alkylfosfátových esterov (16). Pri trans­fosfatidylačných reakciách sú uprednosťované najmä primárne alkoholy (napr. metanol, glycerol) a N-hetero­cyklické alkoholy (17).

1.2. PLD?-formy

Za krátky čas po identifikácii PLD? bola v Arabidop­sis thaliana (L.) Heynh. identifikovaná ďalšia PLD, ktorá mala v AK-sekvencii len 40% podobnosť s PLD?. Táto nová forma (označená ako PLD?) má aj iné enzýmové vlastnosti. PLD tejto skupiny sú Ca2+-dependentné (10 – 50 ?M), fosfatidylinozitol-4,5-difosfát (PIP2) – dependentné a pH optimum majú v neutrálnej oblasti (7,0 – 7,5) (18).

1.3. PLD?-, PLD?-, PLD?-formy

Ďalšie dva izoenzýmy PLD v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., označené ako PLD?1 a PLD?2 (kvôli 87% podobnosti), vykazujú v AK-sekvencii vyše 66% podobnosť k PLD? a 41% podobnosť k PLD?. Sú tiež Ca2+- a PIP2-dependentné (7).

Nedávno boli v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. identifikované ďalšie tri izoenzýmy: PLD?3, PLD?1 a PLD?2. Ich označenie je spravidla závislé od AK-homológie k predchádzajúcim typom PLD (4). Poslednou formou enzýmu, ktorá bola identifikovaná v tejto rastline, je izoenzým PLD?1 (19).

2. Substrátová špecifita PLD?, PLD? a PLD?

Ako vyplýva z predchádzajúcich údajov, najväčšie množstvo detailných informácii o jednotlivých formách PLD pochádza v súčasnosti práve z Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Nové rastlinné PLD tak možno na základe homológie k uvedeným formám PLD zaradiť do príslušnej skupiny.

PLD? hydrolyticky štiepi PC, PE a PG, pričom PLD? a PLD? nevykazujú aktivitu k žiadnemu z uvedených fosfolipidov. Ak je však v substrátových vezikulách prítomný PIP2, PLD? si hydrolytickú aktivitu voči PC, PE a PG zachováva, pričom PLD? i PLD? získavajú schopnosť hydrolyzovať PE a PS. Podobný efekt bol pozorovaný i za súčasnej prítomnosti PIP2 a PE. V tomto prípade je aktivita PLD? a PLD? rozšírená o štiepenie PC, PG a N–acylfosfatidyletanolamínu (NAPE). PLD? pôsobí v rovnakej miere na PC a NAPE, ale PLD? preferuje ako substrát NAPE približne 3-krát viac ako PC. Jednotlivé výsledky umožnili identifikáciu tzv. PS- a NAPE-hydrolyzujúcich PLD a indikovali dôležitú úlohu pre lipidové zloženie v regulácii substrátovej selektivity PLD? a PLD?. Žiadna z uve­dených PLD však nevyužíva ako substrát PI, CL alebo PIP2 (20) (tab. 2).

3. Katalytický mechanizmus PLD

Už v roku 1970 (23) bolo na základe použitia značeného [3H]-PG ukázané, že pri syntéze CL pomo­cou PLD sa môže tvoriť fosfatidyl-enzýmový komplex a že reakcia pravdepodobne prebieha tzv. ping-pongo­vým mechanizmom. Tento predpoklad bol potvrdený nedávno, a to pri štúdiu katalytického mechanizmu reakcie endonukleázy Nuc (Salmonella typhimurium) – patriacej do superrodiny PLD, v prítomnosti znače­ného [32P]-fosfátu (24).

Po pridaní značenej [18O]-H2O pri hydrolýze PC pomocou PLD (Streptomyces chromofuscus) bolo na druhej strane preukázané, že namiesto C-O väzby je štiepená P-O väzba, keďže po ukončení reakcie sa 18O nachádza v kyseline fosfatidovej (PA) a nie v uvoľne­nom cholíne (25).

3.1. Objasnenie katalytického mechanizmu PLD pomocou endonukleázy Nuc

I keď pomocou bodových mutácií boli identifikované AK aktívneho centra v rámci HKD-motívov, donedáv­na nebolo jasné, ktoré AK týchto úsekov tvoria kovalentnú väzbu s fosforom fosfolipidu. Až bodovou mutáciou v endonukleáze Nuc (patriacej do super­rodiny PLD) bolo preukázané, že len histidín sa nachádza vo vhodnej polohe pre tvorbu uvedeného fosfo-enzýmového komplexu (24). Následne sa poda­rila aj kryštalizácia endonukleázy Nuc, čo umožnilo pohľad na sekundárnu a terciárnu štruktúru proteínu pomocou röntgenovej kryštalografie, ako aj na aktívne centrum enzýmu.

V súčasnosti je všeobecne uznávaný dvojstupňový katalytický mechanizmus, pričom na katalytickom procese sa zúčastňujú dve molekuly enzýmu (obr. 1) (26).V prvom kroku atakuje imidazolový dusík histi­dínu molekuly enzýmu A fosforový atóm substrátu a vzniká fosfo-enzýmový intermediát. Histidín enzýmovej molekuly B funguje ako kyselina, ktorá protonizuje kyslík uvoľneného alkoholu. V druhom kroku tohto ping-pongového mechanizmu je fosfo-enzýmový intermediát hydrolyzovaný a fosfatidát je enzýmom uvoľnený. Glutamátové zbytky (nachádza­júce sa v susedstve histidínu) stabilizujú iónové formy histidínu znížením pKa.

3.2. Katalytický mechanizmus „pravých“ PLD

Keďže sú HKD-motívy prakticky pri všetkých PLD konzervované, možno objasnený katalytický mechanizmus pri endonukleáze Nuc (patriacej do superrodiny PLD) „preniesť“ aj na ostatné PLD. Nedávno sa podarilo kryštalizovať aj prvú „pravú“ PLD zo Streptomyces species (27), čo umožnilo bližšie preskúmať jej aktívne centrum. Bolo zistené, že namiesto glutamátu vytvára vodíkový mostík k imida­zolovému dusíku aspartát. Druhý aspartát je však príliš vzdialený a nedovoľuje tvorbu vodíkovej väzby s druhým histidínom. V súčasnosti je už známa aj kryštalická štruktúra prvej rastlinnej PLD (Vigna unguiculata L. Walp.) (28). Ale až kryštalizácia ďalších PLD umožní hlbší pohľad do uvedenej problematiky.

Literatúra

1.    HANAHAN, D. J., CHAIKOFF, A.: A new phospholipid-splitting enzyme specific for the ester linkage between the nitrogenous base and the phosphoric acid grouping. J Biol Chem, 169, 1947, s. 699 – 705.
2.    HELLER, M.: Phospholipase D. Adv Lipid Res, 16, 1978, s. 267 – 326.
3.    WANG, X., WANG, C., SANG, Y., ZHENG, L., QIN, CH.: Lipids and signalling: phospholipase-mediated pathways. Biochem Soc Trans., 28, 2000, s. 813 – 816.
4.    WANG, X.: Multiple forms of phospholipase D in plants: the gene family, catalytic and regulatory properties, and cellular functions. Prog Lipid Res, 39, 2000, s. 109 – 149.
5.    ABOUSALHAM, A., NARI, J., NOAT, G.: Phospholipase D from plants: purification, enzymology and structural analysis. Curr Top Plant Biol, 1, 1999, s. 123 – 132.
6.    PAPPAN, K., QIN, W., DYER, J. H., ZHENG, L., WANG, X.: Molecular cloning and functional analysis of poly­phosphoinositide-dependent phospholipase D, PLD?, from Arabidopsis. J Biol Chem, 272, 1997, s. 7055 – 7061.
7.    QIN, W., DYER, J. H., ZHENG, L., WANG, X.: Isolation and nucleotide sequence of the fourth phospholipase D (Accession No. AF138281), PLD-?2, from Arabidopsis. Plant Physiol, 120, 1999, s. 635.
8.    WANG, X., DYER, J. H., ZHENG, L.: Purification and immunological analysis of phospholipase D from castor bean endosperm. Arch Biochem Biophys, 306, 1993, s. 486 – 494.
9.    UEKI, J., MORIOKA, S., KOMARI, T., KUMASHIRO, T.: Purification and characterization of phospholipase D (PLD) from rice (Oryza sativa L.) and cloning of cDNA for PLD from rice and maize (Zea mays L.). Plant Cell Physiol, 36, 1995, s. 903 – 914.
10.    PANNENBERG, I., MANSFELD, J., ULBRICH-HOFMANN R.: Identification of two isoenzymes (Acc.Nos. AF090444 and AF090445) of phospholipase D from cabbage (Brassica oleracea var. capitata). Plant Physiol, 118, 1998, s. 1102.
11.    FRANK, W., MUNNIK, T., KERKMANN, K., SALAMINI, F., BARTELS, D.: Water deficit triggers phospholipase D activity in the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Cell, 12, 2000, s. 111 – 123.
12.    LEIN, W., SAALBACH, G.: Cloning and direct G-protein regulation of phospholipase D from tobacco. Biochim Biophys Acta, 1530, 2001, s. 172 – 183.
13.    PAPPAN, K., WANG, X.: Plant phospholipase D alpha is an acidic phospholipase active at near-physiological Ca2+ concentrations. Arch Biochem Biophys, 368, 1999, s. 347 – 353.
14.    DYER, J. H., RYU, S. B., WANG, X.: Multiple forms of phospholipase D following germination and during leaf development of castor bean. Plant Physiol, 105, 1994, s. 715 – 724.
15.    BECHER, A., WISSING, J. B., WYLEGALLA, C., WAGNER, K. G.: Phosphatidylinositol specific isoenzymes of phospholipase D from Catharanthus roseus. Purification and characterization. Plant Sci, 97, 1994, s. 143 – 151.
16.    DITTRICH, N., HAFTENDORN, R., ULBRICH-HOFMANN, R.: Hexadecylphosphocholine and 2-modi­fied 1,3-diacylglycerols as effectors of phospholipase D. Biochim Biophys Acta, 1391, 1998, s. 265 – 272.
17.    HIRCHE, F., SCHIERHORN, A., SCHERER, G., ULBRICH-HOFMANN, R.: Enzymatic introduction of N-heterocyclic and As-containing head groups into glycerophospholipids. Tetrahedron Lett, 38, 1997, s. 1369 – 1370.
18.    QIN, W., PAPPAN, K., WANG, X.: Molecular hetero­genity of phospholipase D (PLD): cloning of PLD? and regulation of PLD?,-?, and -? by polyphosphoinositides and calcium. J Biol Chem, 272, 1997, s. 28267 – 28273.
19.    QIN, CH., WANG, X.: The Arabidopsis phospholipase D family. Chracterization of a calcium-indipendent and phosphatidylcholine-selective PLD?1 with distinct regulatory domains. Plant Physiol, 128, 2002, s. 1057 – 1068.
20.    PAPPAN, K., BROWN, S. A., CHAPMAN, K. D., WANG, X.: Substrate selectivities and lipid modulation of plant phospholipases D?,-?, and -?. Arch Biochem Biophys, 353, 1998, s. 131 – 140.
21.    DYER, J. H., ZHENG, S., WANG, X.: Cloning and nucleotide sequence of a cDNA encoding phospholipase D from Arabidopsis. Plant Physiol, 109, 1995, s. 1497.
21.    EL MAAROUF, H., CARRIERE, F., RIVIERE, M., ABOUSALHAM, A.: Functional expression in insect cells, one-step purification and characterization of a recombi­nant phospholipase D from cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.). Protein Eng, 13, 2000, s. 811 – 817.
22.    ALMQUIST, K. C., PALIYATH, G.: Cloning and sequencing of a full-length cDNA coding for phospho­lipase D alpha (Accession No. AF201661) from tomato (PGR 00-013). Plant Physiol, 122, 2000, s. 292.
23.    STANCEV, N.Z., STUHNE-SEKALEC, L.: On the mechanism of enzymatic phosphatidylation. Biosynthesis of cardiolipin catalyzed by phospholipase D. Biochim Biophys Acta, 210, 1970, s. 350 – 352.
24.    GOTTLIN, E.B., RUDOLPH, A.E., ZHAO, Y.,
MATTHEWS, H.R., DIXON, J.E.: Catalytic mechanism of the phospholipase D superfamily proceeds via covalent phosphohistidine intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1998, s. 9202 – 9207.
25.    HOLBROOK, P. G., PANNELL, L. K., DALY, J. W.: Phospholipase D-catalyzed hydrolysis of phosphatidyl­choline occurs with P-O bond cleavage. Biochim Biophys Acta, 1084, 1991, s. 155 – 158.
26.    STUCKEY, J. A., DIXON, J. E.: Crystal structure of a phospholipase D family member. Nature Struct Biol, 6, 1999, s. 278 – 284.
27.    LEIROS, I., SECUNDO, F., ZAMBONELLI, C., SERVI, S., HOUGH, E.: The first crystal strucure of a phospholipase D. Structure Fold Des, 8, 2000, s. 655 – 657.
28.    ABERGEL, CH., ABOUSALHAM, A., CHENIVESSE, S., RIVIERE, M., MOUSTACAS-GARDIES, A.M., VERGER, R.: Crystallization and preliminary crystallographic study of a recombinant phospholipase D from cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.). Acta Crystal D Biol Crystal, 57, 2001, s. 320 – 322.

Skratky:

• HKD – histidín-lyzín-aspartát, CL – kardiolipín,
• NAPE – N-acylfosfatidyletanolamín, PA – kyselina fosfatidová,
• PC – fosfatidylcholín, PE – fosfatidyletanolamín,
• PG – fosfatidylglycerol, PI – fosfatidylinozitol,
• PIP2 – fosfatidylinozitol-4,5-difosfát, PLA2 – fosfolipáza A2,
• PLC – fosfolipáza, PLD – fosfolipáza D, PS – fosfatidylserín,

M. OBLOŽINSKÝ, L. BEZÁKOVÁ
Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv, Farmaceutická fakulta, UK,  Bratislava

MOLECULAR-BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF PLANT PHOSPHOLIPASES D

The review article summarizes the knowledge on molecular-biological characterization of plant phospholipases D (PLD, EC 3.1.4.4). This enzyme plays an important role in signal transduction processes. Recently, PLD has attracted much attention because of the study of membrane phospholipids and phospholipases functions in cellular regulation. The paper focuses the PLD isoforms, in respect to their catalytic activity and substrate specifity. Also, the problem of molecular strucutre is developed.
Keywords: Phospholipase D – isoenzymatic forms – catalytic activity – substrate specifity