• V. Jánošová, M. Sýkorová, O. Štroffeková, E. Havránek
• Stanovenie obsahu vybraných prvkov vo výživovom doplnku rádionuklidovou röntgenofluorescenčnou analýzou
• fARM oBZ, 79, 2010, 6, S. 177-181

Práca sa zaoberá vypracovaním metodiky polykomponentného stanovenia prvkov v kapsuliach  výživového doplnku patriaceho do skupiny prípravkov tradičnej čínskej medicíny rádionuklidovou röntgenofluorescenčnou analýzou (RRFA). Na analýzu bol použitý rádionuklidový zdroj 238Pu a polovodičový Si/Li detektor. Analyzované boli dva prípravky. Obsah vybraných prvkov bol stanovený v náplni kapsulí a obsah TiO2 v želatínových obaloch. Na základe nameraných spektier náplní kapsúl, ktoré boli zlisované do tabliet, boli vo vzorkách identifikované prvky Mn, Fe, Cu, Zn a Pb. V obale bol identifikovaný Ti. Na stanovenie obsahu prvkov boli pripravené štandardy. Vzorka č. 1 obsahovala v náplni 24,91 ?g.g-1 Mn, 399,20 ?g.g-1 Fe, 14,18 ?g.g-1 Cu, 10,39 ?g.g-1 Zn a Pb < 1,62 ?g.g-1. Vzorka č. 2 obsahovala 18,93 ?g.g-1 Mn, 193,37 ?g.g-1 Fe, 17,61 ?g.g-1 Cu, 25,60 ?g.g-1 Zn a Pb < 1,62 ?g.g-1. Obsah TiO2 stanovený v obale – želatínových kapsuliach vzorky č. 1 bol 16,86 mg.g-1 a vzorky č. 2 bol 4,57 mg.g-1. RRFA je vhodná na identifikáciu a stanovenie obsahu prvkov vo vzorkách liekov a liečiv. Na základe prvkovej analýzy umožnila rozlíšiť originálne liečivo od generika.

Kľúčové slová: rádionuklidová röntgenofluorescenčná analýza – výživové doplnky – čínska medicína – ťažké kovy

Fytofarmaká sú v porovnaní s klasickými liekmi chemicky zložité zmesi, tvorené niekoľkými zložkami zodpovednými za farmakologické účinky. Obsahové látky sa môžu rozdeliť na účinné (vyvolávajúce vlastný liečebný efekt) a vedľajšie (modifikujúce hlavný liečebný účinok) a na nežiaduce, ktorých prítomnosť negatívne ovplyvňuje terapeutickú hodnotu rastlin­ných drog. Medzi nežiaduce obsahové látky v rastlin­ných drogách patria kontaminanty najmä zo skupiny ťažkých kovov ako sú olovo, kadmium, ortuť a arzén, ktoré predsta­vujú zdravotné riziko pre pacienta. Preto je nevyh­nutné v rastlinných drogách tieto kovy identifikovať a stanoviť ich obsah.

Nečistoty v liekoch môžu pôsobiť toxicky, inkompatibilne, môžu sa kumulovať v organizme, ovplyvňovať farmakokinetiku liečiva alebo jeho stabilitu, čo v konečnom dôsledku negatívne ovplyv­ňuje terapeutickú hodnotu lieku. Nečistoty sa do liekov dostávajú pri spracovaní jeho jednotlivých komponentov, pri samotnom výrobnom procese, prípadne vznikajú v priebehu nesprávneho sklado­vania a používania (1).

Záväzným normatívom pre kvalitatívne požiadavky na lieky je Slovenský liekopis. Prakticky vo všetkých liekopisných článkoch je medzi skúškami na čistotu zaradená i Skúška na ťažké kovy. SL 1 vo všeobecnej kapitole 2.4 Limitné skúšky pre anorganické nečistoty uvádza aj podkapitolu 2.4.8 Ťažké kovy, v ktorej sú uvedené jednotlivé metódy A až F. Sú to nešpecifické skúšky založené na tvorbe farebných sulfidov ťažkých kovov s tioacetamidovým činidlom v slabo kyslom prostredí. Majú semikvantitatívny charakter – vyhodnocujú sa na základe porovnania skúšaného roztoku vzorky s referenčným roztokom (2). Táto skúška poskytuje len všeobecnú informáciu o obsahu ťažkých kovov ako o celej skupine. Na rozlíšenie jednotlivých prvkov tejto skupiny ako aj na stano­venie ich obsahu sa v odbornej literatúre často vysky­tujú požiadavky na doplnenie liekopisných skúšok na ťažké kovy metódami ICP-MS, ICP-AES (3), XRF (4), AAS (5), NAA (6). Výhodou metód ICP-AES a NAA je nízka medza detekcie, no náklady na ich uskutočnenie sú príčinou ich nedostupnosti pre väčšinu laboratórií (7).

Pri stanovení prvkov v tuhých vzorkách je výhodná röntgenofluorescenčná spektrometria s rôznymi spôsobmi excitácie vzorky. V kombinácii so zakoncentrovaním vzorky možno touto metódou docieliť nízke medze detekcie aj pri polykomponentnej analýze.

Rádionuklidová röntgenofluorescenčná analýza (RRFA) ako interakčná neaktivačná metóda patrí medzi nukleárne analytické metódy. Je založená na interakcii nízkoenergetického žiarenia gama a X (s energiou menšou ako 150 keV) s látkou (8).

Výhodou RRFA je vysoká citlivosť, presnosť a se­lek­tívnosť, možnosť polykomponentnej analýzy a ne­deštruk­tívnosť. RRFA však neumožňuje rozlíšiť jednotlivé chemické formy identifikovaných prvkov (8, 9).

V liekopise SL 1 je RRFA uvedená ako röntgenofluorescenčná spektrometria. Vo farmácii nachádza uplatnenie predovšetkým pri identifikácii a stanovení prvkov (s protónovým číslom 11 – 92) buď ako súčastí samotnej účinnej látky, alebo prvkov ako nečistôt (ťažké kovy) v liekoch, liečivách, farma­ceutických pomocných látkach, liečivých rastlinách. Na základe prvkového zloženia vzorky navyše umožňuje zistiť pôvod liečiva, t. j. rozlíšiť originál od generika.

Analyzovaný materiál a metódy

Cieľom práce bolo vypracovať metodiku (na základe požiadaviek zadávateľa) na identifikáciu a stanovenie obsahu prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb rádionuklidovou röntgenofluorescenčnou analýzou v náplni kapsúl z dvoch vzoriek rastlinných prípravkov zložených z liečivých rastlín Ázie používaných najmä v čínskej medicíne a vypracovať metodiku na identifikáciu a stanovenia TiO2 v želatínových kapsuliach, ktoré boli použité ako obal. Na základe týchto analýz mala byť potvrdená, alebo vyvrátená identita originálu a gene­rika. Analyzované boli dve vzorky výživových do­plnkov čínskej medicíny – želatínové kapsule modrej farby. Zloženie generického prípravku na rozdiel od zloženia originálneho výživového doplnku, ktorého náplň tvorila práškovaná zmes rastlinných drog (Dioscorea spinosa – podzemok 75 mg, Lycum barbarum – plod 75 g, Coix lachrymae – semená 45 mg, Glyccyrhiza glabra – podzemok 45 mg, Euryale Jerox – semená 30 mg, Lilium brownie – hľuza 30 mg) nebolo známe. Analyzovaná bola náplň aj prázdne želatínové kapsule (obal). Výrobca vzorky č. 2 deklaroval 5 mg TiO2.

Primárnym zdrojom žiarenia bol plošný diskový rádionuklidový zdroj 238Pu (energia 12 – 22 keV, aktivita 370 MBq a polčas premeny 86,4 roka). Vzniknuté fluorescenčné žiarenie bolo detegované polovodičo­vým Si/Li detektorom, na vyhodnotenie bol použitý mnohokanálový analyzátora EG&G ORTEC a program MEASTRO - 32®. Na analýzu vzoriek bola použitá bočná reflexná geometria vzorka – zdroj – detektor.

Vlastnej príprave štandardov predchádzalo overenie charakteru vzorky, najmä jej absorpčných vlastností, keďže intenzita fluorescenčného žiarenia závisí priamoúmerne od koncentrácie prvku vo vzorke a nepriamoúmerne od jej absorpčných vlastností.

Referenčné roztoky a chemikálie

Certifikovaný referenčný materiál dodaný Slovenským metrologickým ústavom s deklarovanou koncentráciou prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb 1 g.l-1.

Príprava vzoriek

Na stanovenie obsahu prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb v náplni vzorky bol pripravený štandard z matrice – rastliny Medicago sativa L. Táto rastlina bola v práškovej forme zlisovaná pod tlakom 10 MPa do tabliet s hmot­nosťou 0,3000 g a s priemerom 20 mm, ktoré boli podrobené RRFA. Na lisovanie bol použitý ručný tabletovací lis CARL ZEISS JENA 036-76. Štandardy na stanovenie obsahu prvkov vo vzorke boli pripravené pridaním k 1,0000 g práškovej rastliny Medicago sativa L. po 100,0 ?l štandardných roztokov prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb (1,0 ?g prvku/1,0 ?l). Po usušení, homogenizovaní a zvážení boli pripravené tablety (0,3000 g, 10 MPa, 20 mm), ktoré sa analyzovali RRFA.

Práškovaná náplň kapsúl vzoriek č. 1 a 2 bola zlisovaná do tabliet (0,3000 g, priemer 20 mm, tlak 10 MPa) a tablety boli podrobené RRFA.

Výsledky a diskusia

Na posúdenie charakteru práškovanej zmesi a že­latínových obalov boli zmerané pôvodné plné kapsule vzorky č. 1 a 2 bez akejkoľvek úpravy. Identifikované boli prvky Ti, Mn, Fe, Cu a Zn. Prítomnosť Pb nebola potvrdená Na základe týchto orientačných meraní boli vybrané spôsoby úpravy vzorky a štandardu. Na stanovenie obsahu prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb v náplni vzorky bola na prípravu štandardu vybraná matrica – Medicago sativa L. Z práškovej formy rastliny boli lisované tablety, ktoré boli podrobené RRFA.

Pre stanovenie obsahu prvkov vo vzorke bol použitý spôsob štandardného prídavku prvkov. Na práškovanú rastlinu Medicago sativa L. (1,0000 g) bolo nanesených po 100,0 ?l štandardných roztokov prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb. Pripravené tablety boli analyzovalné RRFA. Získané hodnoty a štatistické spracovanie nameraných početností v matrici so štandardným prídavkom prvkov Mn, Fe, Cu, Zn a Pb v troch pripravených tabletách uvádza tabuľka 1.

RRFA analýze boli podrobené i prázdne želatínové kapsule vzoriek č. 1 a 2. Po zmeraní spektra v nich bol identifikovaný Ti. Výrobca ho používa vo forme TiO2. SL 1 predpisuje cerimetrické stanovenie obsahu TiO2 so zložitou úpravou vzorky. RRFA umožňuje zistiť obsah TiO2 vo vzorke na základe stanovenia Ti. Vzorky (kapsule) museli byť upravené do definovaného tvaru s hladkým povrchom, nebolo však možné použiť spôsob prípravy vzorky lisovaním. Keďže želatínové kapsule sú na rozdiel od TiO2 rozpustné vo vode, bol zvolený postup zachytenia TiO2 na membránovom filtri po rozpustení kapsule s následnou analýzou membránového filtra RRFA. Stanoveniu TiO2 v že­latínových obaloch kapsúl predchádzala príprava štandardu. Bol pripravený suspendovaním 5,0 mg TiO2 v 20 ml demineralizovanej vody a prefiltrovaním zmesi cez membránový filter PRAGOPOR č. 3 (priemer filtra 45 mm, veľkosť pórov 1,5 ?m). Filter so zachyteným TiO2 bol po vysušení podrobený RRFA.

Tablety zlisovanej práškovanej náplne kapsúl vzoriek č. 1 a 2 boli podrobené RRFA. Namerané hodnoty početností pre tablety vzoriek č. 1 a 2, prepočítané na jednotnú hmotnosť 0,3000 g a štatisticky spracované, uvádzajú tabuľky 2. a 3.

V nameraných spektrách boli na základe energetickej kalibrácie identifikované prvky Mn, Fe, Cu, Zn a Pb a bol vymedzený energetický interval, v ktorom nameraná početnosť (analytický signál) závisela od koncentrácie prvku. Z priebehu získaných spektier sa zistila hodnota neanalytického signálu, ktorý bol daný priemernou minimálnou hodnotou početností pred a za píkom daného prvku vynásobený počtom meraných kanálov.

Z hodnoty zisku na štandardný prídavok, obsahu prvku v štandardnom prídavku a hodnoty neanalytického signálu bol vypočítaný detekčný limit pre tabletu (0,3000 g) a pre 1,0000 g vzorky. Detekčný limit pre daný typ stanovenia obsahu vybraného prvku v rastlinnej vzorke bol: Mn 6,26 ?g.g-1, Fe 4,25 ?g.g-1, Cu 1,72 ?g.g-1, Zn 1,14 ?g.g-1 a Pb 1,62 ?g.g-1.

Obsah prvkov v náplni kapsúl vzoriek bol vypočítaný na základe rozdielu početností nameraných pre tablety náplní kapsúl vzorky korigovaných o neanalytický signál a početností zodpovedajúcich štandardnému prídavku prvkov. Výsledné obsahy vybraných prvkov vo vzorkách č. 1 a 2 sú uvedené v tabuľke 4. Rozdiely v obsahu Fe a Zn ukázali, že náplne kapsúl nie sú identické.

Želatínové obaly kapsúl vzoriek č. 1 a 2 boli suspendované v 20 ml demineralizovanej H2O, zmes bola prefiltrovaná cez membránový filter PRAGOPOR č. 3 a filter sa po vysušení podrobil RRFA. Namerané početnosti uvádza tabuľka 5.

Obsah TiO2 v kapsuliach bol vypočítaný na základe porovnania nameraných početností štandardu – filtra s 5,0 mg TiO2 a filtra s prefiltrovanou suspenziou prázdnych kapsulí vzoriek, ktoré boli korigované o ne­analytický signál (čistý membránový filter). Výsledky stanovenia obsahu TiO2 v prázdnej kapsule vzoriek č. 1 a 2 sú uvedené v tabuľke 6. Zvolený spôsob prípravy štandardu a vzoriek mal veľmi dobrú repro­duko­vateľnosť. V spektrách filtra vzoriek č. 1 a vzoriek č. 2 neboli identifikované ďalšie prvky.

Vzorka č. 1 obsahuje 16,88 mg.g-1 TiO2 a vzorka č. 2 obsahuje 4,57 mg.g-1 TiO2. Na základe uvedenia zadávateľa vzorka č. 2 bola originálna, mala by obsahovať 5,00 mg.g-1 TiO2. Z výsledkov jednoznačne vyplýva, že porovnávané vzorky č. 1 a č. 2 nie sú identické.

Analýza prvkov v liekoch je dôležitá i z hľadiska kontroly kvality liekov a liečiv a zisťovania pravosti lieku, jeho pôvodu. Často možno na základe takejto analýzy odlíšiť originál od generika či falzifikátu, alebo zistiť priamo výrobcu – producenta pri dodávaní liečiv alebo výživových doplnkov rôznymi distribučnými firmami.

RRFA analýza výživových doplnkov obsahujúcich rastlinné drogy umožnila identifikáciu prvkov Mn, Fe, Cu, Zn, Pb v náplni kapsúl a Ti v želatínových obaloch a bol stanovený ich obsah. Na základe prvkovej ana­lýzy sa potvrdilo rozdielne zloženie vzoriek č. 1 a 2. Prvková analýza náplne kapsúl bola rýchla, polykomponentná, bez chemickej deštrukcie matrice, a tým bola výhodnejšia ako AAS. Vhodným bolo i použitie RRFA pri stanovení obsahu TiO2 v žela­tínových kapsuliach – obale pre svoju rýchlosť a jednoduchosť. Bola odstránená zdĺhavá príprava vzorky na cerimetrické stanovenie obsahu TiO2, ktorú vyžaduje SL1. Reprodukovateľnosť prípravy vzorky na RRFA poukazuje na vhodnosť danej metódy pri kontrole liekov, liečiv a farmaceutických pomocných látok.

Práca je súčasťou výskumného programu podporovaného v rámci grantovej úlohy č. 1/4299/07 a č. 1/0003/08 grantovou agentúrou MŠ SR VEGA, a grantovej úlohy UK/44/2007.

LITERATÚRA

1.    BEZÁKOVÁ, Ž.: Analýza chemických liečiv. Skúšky na čistotu liečiv I. 1. vydanie. Bratislava: UK, 1995, 153 s.,
2.    Slovenský liekopis.., zv. I, Bratislava: Herba, 1997, 657 s.
3.    Slovenský liekopis. 1. vyd., zv. II, Bratislava: Herba, 1999, 1400 s.
4.    RAO, R. N., TALLURI, M. V. N. K.: An overview of recent applications of inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) in determination of inorganic impurities in drugs and pharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal, 43, 2007, 1, s. 1 – 13.
5.    ŠTROFFEKOVÁ, O., HAVRÁNEK, E.: Use of chelating extraction membranes for the identification and determination of heavy metals using radionuclide X-ray fluorescence analysis. Čes slov Farm, 53, 2004, 6, s. 323 – 327.
6.    SORIANO, S., NETTO, A. D. P., CASSELLA, R. J.: Determination of Cu, Fe, Mn and Zn by flame atomic absorption spectrometry in multivitamin/multimineral dosage forms or tablets after an acidic extraction. J Pharm Biomed Anal, 4, 2007, s. 304 – 310.
7.    YAMASHITA, C. I., SAIKI, M., SERTIE, J. A. A.: Elemental analysis of leaves and extracts of Casearia medicinal plants by instrumental neutron activation analysis.  J Radioanal Nucl Chem, 1, 2006, s. 181 – 186.
8.    KELKO-LEVAI, A., VARGA, I., ZIH-PERENYI, K., LASZTITY, A.: Determination of trace elements in pharmaceutical substances by graphite furnace atomic absorption spectrometry ans total reflexion X-ray fluorescence after flow ion-exchange preconcentration. Spectrochim Acta Part B, 54, 1999, s. 927 – 933.
9.    TÖLGYESSY, J., HAVRÁNEK, E., DEJMKOVÁ, E.: Rádionuklidová röntgenofluorescenčná analýza zložiek životného prostredia. Bratislava: Alfa, 1983, 203 s.

V. JÁNOŠOVÁ, M. SÝKOROVÁ, O. ŠTROFFEKOVÁ, E. HAVRÁNEK
Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava

SUMMARY

V. Jánošová, M. Sýkorová, O. Štroffeková, E. Havránek

DETERMINATION OF SELECTED ELEMENTS IN DIETARY SUPPLEMENT BY X-RAY FLUORESCENCE ANALYSIS

This work is aimed to elaborate a methodology of polycomponent element determination in dietary supplement capsules of chinese medicine by radionuclide x-ray fluorescence analysis (XRF). Radionuclide source 238Pu and Si/Li semiconductor detector were used for the analysis. Two samples of supplements were analyzed, content of chosen elements was determined in the fill of capsules and content of TiO2 in gelatin capsule shells. Following the obtained spectrum of the capsule fills which were pressed into tablets, the elements Mn, Fe, Cu, Zn and Pb were idetified in samples. Ti was identified in the shells. For determination of elements content, standards were prepared. Sample 1 contained in the capsule fill
24,91 ?g.g-1 Mn, 399,20 ?g.g-1 Fe, 14,18 ?g.g-1 Cu,
10,39 ?g.g-1 Zn and Pb < 1,62 ?g.g-1. Sample 2
contained 18,93 ?g.g-1 Mn, 193,37 ?g.g-1 Fe,
17,61 ?g.g-1 Cu, 25,60 ?g.g-1 Zn and Pb < 1,62 ?g.g-1. Content of TiO2 determined in capsule gelatin shells was 16,86 mg.g-1 in sample 1 and 4,57 mg.g-1 in
sample 2. Radionuclide XRF is suitable for the idetification and determination of elements in drugs and pharmaceuticals samples. Based on element analysis, this method allows to differ a brand name drug from a generic drug.
Key words: radionuclide x-ray fluorescence analysis – dietary supplements – chinese medicine – heavy metals.