• M. Obložinský, L. Bezáková
• Molekulárno-biologická charakterizácia rastlinných fosfolipáz D
• Farm Obz, 79, 2010, 6, s. 153-157

Prehľadná práca sumarizuje poznatky o molekulárno-biologickej charakterizácii rastlinných fosfolipáz D (PLD, EC 3.1.4.4). Tento enzým plní jednu z kľúčových úloh v signálne transdukčných procesoch. V ostatnom čase sa PLD stala objektom intenzívneho záujmu, a to v dôsledku štúdia úloh membránových fosfolipidov a fosfolipáz v bunkovej regulácii. V práci sa venuje pozornosť jednotlivým izoformám PLD, najmä z pohľadu ich katalytickej aktivity a substrátovej špecifity. Rozpracovaná je aj problematika molekulárnej štruktúry izoenzýmov.

Kľúčové slová: Fosfolipáza D – izoenzýmové formy – katalytická aktivita – substrátová špecifita

Aktivita fosfolipázy D (PLD, EC 3.1.4.4) bola v rastlinných pletivách preukázaná už v pätdesiatych rokoch minulého storočia (1). Jej prítomnosť bola neskôr dokázaná aj v živočíchoch, hubách a baktériách (2). Ako typický katabolický enzým (t. j. lipáza schopná degradácie fosfolipidov) však PLD nebola tak zaujíma­vá ako iné fosfolipázy, najmä fosfolipáza A2 (PLA2) a fosfolipáza C (PLC). V ostatnom čase sa PLD opäť stala objektom intenzívneho záujmu, a to v dôsledku štúdia úloh membránových fosfolipidov a fosfolipáz v bunkovej regulácii (3). Keďže substrátmi PLD sú za natívnych podmienok zložky bunkových membrán (fosfolipidy formujú základnú matrix biologickej membrány), majú tieto aktivity (najmä hydrolytická aktivita PLD) výrazný vplyv na ich zloženie, štruktúru a stabilitu. Transfosfatidylačná aktivita PLD by pritom mohla predstavovať aj potenciálny nástroj transfor­mácie fosfolipidov bunkových membrán (4).

1. Rastlinné formy PLD

Zo všetkých typov fosfolipáz sa PLD zdá byť prevládajúcim typom práve v rastlinných pletivách (5). Rastlinné PLD (tab. 1) sa rozdeľujú podľa všeobecne uznávanej klasifikácie pracovnej skupiny prof. X. Wanga (Manhattan KS, USA) do skupín: PLD?, PLD?, PLD? a PLD?. Táto pracovná skupina sa zaoberá detailným štúdium PLD v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Skríningom v génovej databanke bolo identifikovaných sedem izoenzýmov, z ktorých päť je v rastline aj skutočne exprimovaných (6, 7).

1.1. PLD?-formy

Prvá identifikovaná PLD v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. bola označená ako PLD?. Sekvenčné porov­nania génov iných, už osekvenovaných PLD (Ricinus communis L. (8), Oryza sativa L. a Zea mays L. (9), Brassica oleracea L. (10)), ale aj novoidentifikovaných PLD (Craterostigma plantagineum L. (11), Nicotiana tabacum L. (12)), poukazujú na ich zaradenie práve do skupiny PLD?. Všetky tieto PLD sú silne Ca2+-de­pendentné (20 – 100 mM) a majú pH optimum v kyslej oblasti (4,5 – 6,0) (13). Keďže PLD?-forma má u rastlín najvýraznejšie zastúpenie, bola izolovaná a purifiko­vaná z rôznych rastlinných zdrojov.

Pri izolácii PLD z Ricinus communis L. bolo dokonca identifikovaných niekoľko izoenzýmov PLD? (PLD?1, PLD?2, PLD?3). PLD?1 a PLD?2 sa izolovali z dvoj­dňového endospermu a PLD?3 z päťdňového endospermu. Výskyt a aktivita jednotlivých foriem PLD je pritom časovo a vývinovo špecifická. Aktivita PLD?1 a PLD?2 vrcholí v endosperme na druhý deň klíčenia a po treťom dni ju už nemožno zazname­nať. Aktivita PLD?3 sa objavuje v endosperme až na štvrtý deň klíčenia. Počas vývinu listov je aktivita PLD? vyššia v mladších ako v rozvinutých listoch. V mla­dých listoch je aktivita PLD? viazaná na cytozolovú frakciu, kým v plne rozvinutých listoch na mikrozomálnu frakciu. Mladé listy obsahujú najmä PLD?1 a PLD?2. PLD?3 sa nachádza predovšetkým v starších pletivách. Všetky tri formy majú hydro­­-lytický účinok na fosfatidylcholín (PC), fosfatidyletano­lamín (PE) a fosfatidylglycerol (PG). PLD?1 a PLD?2 hydrolyzujú PC a PG vo väčšej miere ako PE, kým PLD?3 vykazuje rovnakú aktivitu voči PC, PE a PG. Rozdiely v substrátovej špecifite jednotlivých foriem PLD sa môžu rôzne premietnuť do funkčného vzťahu k bunke. Aktivácia PLD?1 a PLD?2 môže vyústiť k selektívnej degradácii fosfolipidov, čím sa mení zlo­ženie membrány. Aktivácia PLD?3 môže viesť k celkovej degradácii membránových fosfolipidov (14).

V Catharanthus roseus (L.) G.Don bola identifikovaná špecifická forma PLD, tzv. fosfatidylinozitol (PI) – špecifická PLD. Táto PLD sa vyskytuje v dvoch izoformách, ale na rozdiel od ostatných rastlinných PLD tieto dve izoformy hydrolyticky štiepia len PI. Pri testovaní iných fosfolipidov ako substrátov (PC, PE, PG, PS) nevznikajú žiadne štiepne produkty. PLD z tohto rastlinného zdroja nevykazuje žiadnu transfosfatidylačnú aktivitu a hydrolytická aktivita je stimulovaná prítomnosťou PG. S výnimkou vysokej tepelnej stability a nepatrne nižšieho izoelektrického bodu v proteíne s menšou molekulovou hmotnosťou sú molekulárno-biologické vlastnosti izoenzýmov identické (15).

V Brassica oleracea L. sú známe dva izoenzýmy PLD (PLD?1 a PLD?2) (10). Substrátová špecifita oboch izoenzýmov je široká, od hydrolýzy rôznych fosfolipi­dov (PC, PE, PG, PS, PI, kardiolipín (CL)) (2) až po hydrolýzu alkylfosfátových esterov (16). Pri trans­fosfatidylačných reakciách sú uprednosťované najmä primárne alkoholy (napr. metanol, glycerol) a N-hetero­cyklické alkoholy (17).

1.2. PLD?-formy

Za krátky čas po identifikácii PLD? bola v Arabidop­sis thaliana (L.) Heynh. identifikovaná ďalšia PLD, ktorá mala v AK-sekvencii len 40% podobnosť s PLD?. Táto nová forma (označená ako PLD?) má aj iné enzýmové vlastnosti. PLD tejto skupiny sú Ca2+-dependentné (10 – 50 ?M), fosfatidylinozitol-4,5-difosfát (PIP2) – dependentné a pH optimum majú v neutrálnej oblasti (7,0 – 7,5) (18).

1.3. PLD?-, PLD?-, PLD?-formy

Ďalšie dva izoenzýmy PLD v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., označené ako PLD?1 a PLD?2 (kvôli 87% podobnosti), vykazujú v AK-sekvencii vyše 66% podobnosť k PLD? a 41% podobnosť k PLD?. Sú tiež Ca2+- a PIP2-dependentné (7).

Nedávno boli v Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. identifikované ďalšie tri izoenzýmy: PLD?3, PLD?1 a PLD?2. Ich označenie je spravidla závislé od AK-homológie k predchádzajúcim typom PLD (4). Poslednou formou enzýmu, ktorá bola identifikovaná v tejto rastline, je izoenzým PLD?1 (19).

2. Substrátová špecifita PLD?, PLD? a PLD?

Ako vyplýva z predchádzajúcich údajov, najväčšie množstvo detailných informácii o jednotlivých formách PLD pochádza v súčasnosti práve z Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Nové rastlinné PLD tak možno na základe homológie k uvedeným formám PLD zaradiť do príslušnej skupiny.

PLD? hydrolyticky štiepi PC, PE a PG, pričom PLD? a PLD? nevykazujú aktivitu k žiadnemu z uvedených fosfolipidov. Ak je však v substrátových vezikulách prítomný PIP2, PLD? si hydrolytickú aktivitu voči PC, PE a PG zachováva, pričom PLD? i PLD? získavajú schopnosť hydrolyzovať PE a PS. Podobný efekt bol pozorovaný i za súčasnej prítomnosti PIP2 a PE. V tomto prípade je aktivita PLD? a PLD? rozšírená o štiepenie PC, PG a N–acylfosfatidyletanolamínu (NAPE). PLD? pôsobí v rovnakej miere na PC a NAPE, ale PLD? preferuje ako substrát NAPE približne 3-krát viac ako PC. Jednotlivé výsledky umožnili identifikáciu tzv. PS- a NAPE-hydrolyzujúcich PLD a indikovali dôležitú úlohu pre lipidové zloženie v regulácii substrátovej selektivity PLD? a PLD?. Žiadna z uve­dených PLD však nevyužíva ako substrát PI, CL alebo PIP2 (20) (tab. 2).

3. Katalytický mechanizmus PLD

Už v roku 1970 (23) bolo na základe použitia značeného [3H]-PG ukázané, že pri syntéze CL pomo­cou PLD sa môže tvoriť fosfatidyl-enzýmový komplex a že reakcia pravdepodobne prebieha tzv. ping-pongo­vým mechanizmom. Tento predpoklad bol potvrdený nedávno, a to pri štúdiu katalytického mechanizmu reakcie endonukleázy Nuc (Salmonella typhimurium) – patriacej do superrodiny PLD, v prítomnosti znače­ného [32P]-fosfátu (24).

Po pridaní značenej [18O]-H2O pri hydrolýze PC pomocou PLD (Streptomyces chromofuscus) bolo na druhej strane preukázané, že namiesto C-O väzby je štiepená P-O väzba, keďže po ukončení reakcie sa 18O nachádza v kyseline fosfatidovej (PA) a nie v uvoľne­nom cholíne (25).

3.1. Objasnenie katalytického mechanizmu PLD pomocou endonukleázy Nuc

I keď pomocou bodových mutácií boli identifikované AK aktívneho centra v rámci HKD-motívov, donedáv­na nebolo jasné, ktoré AK týchto úsekov tvoria kovalentnú väzbu s fosforom fosfolipidu. Až bodovou mutáciou v endonukleáze Nuc (patriacej do super­rodiny PLD) bolo preukázané, že len histidín sa nachádza vo vhodnej polohe pre tvorbu uvedeného fosfo-enzýmového komplexu (24). Následne sa poda­rila aj kryštalizácia endonukleázy Nuc, čo umožnilo pohľad na sekundárnu a terciárnu štruktúru proteínu pomocou röntgenovej kryštalografie, ako aj na aktívne centrum enzýmu.

V súčasnosti je všeobecne uznávaný dvojstupňový katalytický mechanizmus, pričom na katalytickom procese sa zúčastňujú dve molekuly enzýmu (obr. 1) (26).V prvom kroku atakuje imidazolový dusík histi­dínu molekuly enzýmu A fosforový atóm substrátu a vzniká fosfo-enzýmový intermediát. Histidín enzýmovej molekuly B funguje ako kyselina, ktorá protonizuje kyslík uvoľneného alkoholu. V druhom kroku tohto ping-pongového mechanizmu je fosfo-enzýmový intermediát hydrolyzovaný a fosfatidát je enzýmom uvoľnený. Glutamátové zbytky (nachádza­júce sa v susedstve histidínu) stabilizujú iónové formy histidínu znížením pKa.

3.2. Katalytický mechanizmus „pravých“ PLD

Keďže sú HKD-motívy prakticky pri všetkých PLD konzervované, možno objasnený katalytický mechanizmus pri endonukleáze Nuc (patriacej do superrodiny PLD) „preniesť“ aj na ostatné PLD. Nedávno sa podarilo kryštalizovať aj prvú „pravú“ PLD zo Streptomyces species (27), čo umožnilo bližšie preskúmať jej aktívne centrum. Bolo zistené, že namiesto glutamátu vytvára vodíkový mostík k imida­zolovému dusíku aspartát. Druhý aspartát je však príliš vzdialený a nedovoľuje tvorbu vodíkovej väzby s druhým histidínom. V súčasnosti je už známa aj kryštalická štruktúra prvej rastlinnej PLD (Vigna unguiculata L. Walp.) (28). Ale až kryštalizácia ďalších PLD umožní hlbší pohľad do uvedenej problematiky.

Literatúra

1.    HANAHAN, D. J., CHAIKOFF, A.: A new phospholipid-splitting enzyme specific for the ester linkage between the nitrogenous base and the phosphoric acid grouping. J Biol Chem, 169, 1947, s. 699 – 705.
2.    HELLER, M.: Phospholipase D. Adv Lipid Res, 16, 1978, s. 267 – 326.
3.    WANG, X., WANG, C., SANG, Y., ZHENG, L., QIN, CH.: Lipids and signalling: phospholipase-mediated pathways. Biochem Soc Trans., 28, 2000, s. 813 – 816.
4.    WANG, X.: Multiple forms of phospholipase D in plants: the gene family, catalytic and regulatory properties, and cellular functions. Prog Lipid Res, 39, 2000, s. 109 – 149.
5.    ABOUSALHAM, A., NARI, J., NOAT, G.: Phospholipase D from plants: purification, enzymology and structural analysis. Curr Top Plant Biol, 1, 1999, s. 123 – 132.
6.    PAPPAN, K., QIN, W., DYER, J. H., ZHENG, L., WANG, X.: Molecular cloning and functional analysis of poly­phosphoinositide-dependent phospholipase D, PLD?, from Arabidopsis. J Biol Chem, 272, 1997, s. 7055 – 7061.
7.    QIN, W., DYER, J. H., ZHENG, L., WANG, X.: Isolation and nucleotide sequence of the fourth phospholipase D (Accession No. AF138281), PLD-?2, from Arabidopsis. Plant Physiol, 120, 1999, s. 635.
8.    WANG, X., DYER, J. H., ZHENG, L.: Purification and immunological analysis of phospholipase D from castor bean endosperm. Arch Biochem Biophys, 306, 1993, s. 486 – 494.
9.    UEKI, J., MORIOKA, S., KOMARI, T., KUMASHIRO, T.: Purification and characterization of phospholipase D (PLD) from rice (Oryza sativa L.) and cloning of cDNA for PLD from rice and maize (Zea mays L.). Plant Cell Physiol, 36, 1995, s. 903 – 914.
10.    PANNENBERG, I., MANSFELD, J., ULBRICH-HOFMANN R.: Identification of two isoenzymes (Acc.Nos. AF090444 and AF090445) of phospholipase D from cabbage (Brassica oleracea var. capitata). Plant Physiol, 118, 1998, s. 1102.
11.    FRANK, W., MUNNIK, T., KERKMANN, K., SALAMINI, F., BARTELS, D.: Water deficit triggers phospholipase D activity in the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Cell, 12, 2000, s. 111 – 123.
12.    LEIN, W., SAALBACH, G.: Cloning and direct G-protein regulation of phospholipase D from tobacco. Biochim Biophys Acta, 1530, 2001, s. 172 – 183.
13.    PAPPAN, K., WANG, X.: Plant phospholipase D alpha is an acidic phospholipase active at near-physiological Ca2+ concentrations. Arch Biochem Biophys, 368, 1999, s. 347 – 353.
14.    DYER, J. H., RYU, S. B., WANG, X.: Multiple forms of phospholipase D following germination and during leaf development of castor bean. Plant Physiol, 105, 1994, s. 715 – 724.
15.    BECHER, A., WISSING, J. B., WYLEGALLA, C., WAGNER, K. G.: Phosphatidylinositol specific isoenzymes of phospholipase D from Catharanthus roseus. Purification and characterization. Plant Sci, 97, 1994, s. 143 – 151.
16.    DITTRICH, N., HAFTENDORN, R., ULBRICH-HOFMANN, R.: Hexadecylphosphocholine and 2-modi­fied 1,3-diacylglycerols as effectors of phospholipase D. Biochim Biophys Acta, 1391, 1998, s. 265 – 272.
17.    HIRCHE, F., SCHIERHORN, A., SCHERER, G., ULBRICH-HOFMANN, R.: Enzymatic introduction of N-heterocyclic and As-containing head groups into glycerophospholipids. Tetrahedron Lett, 38, 1997, s. 1369 – 1370.
18.    QIN, W., PAPPAN, K., WANG, X.: Molecular hetero­genity of phospholipase D (PLD): cloning of PLD? and regulation of PLD?,-?, and -? by polyphosphoinositides and calcium. J Biol Chem, 272, 1997, s. 28267 – 28273.
19.    QIN, CH., WANG, X.: The Arabidopsis phospholipase D family. Chracterization of a calcium-indipendent and phosphatidylcholine-selective PLD?1 with distinct regulatory domains. Plant Physiol, 128, 2002, s. 1057 – 1068.
20.    PAPPAN, K., BROWN, S. A., CHAPMAN, K. D., WANG, X.: Substrate selectivities and lipid modulation of plant phospholipases D?,-?, and -?. Arch Biochem Biophys, 353, 1998, s. 131 – 140.
21.    DYER, J. H., ZHENG, S., WANG, X.: Cloning and nucleotide sequence of a cDNA encoding phospholipase D from Arabidopsis. Plant Physiol, 109, 1995, s. 1497.
21.    EL MAAROUF, H., CARRIERE, F., RIVIERE, M., ABOUSALHAM, A.: Functional expression in insect cells, one-step purification and characterization of a recombi­nant phospholipase D from cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.). Protein Eng, 13, 2000, s. 811 – 817.
22.    ALMQUIST, K. C., PALIYATH, G.: Cloning and sequencing of a full-length cDNA coding for phospho­lipase D alpha (Accession No. AF201661) from tomato (PGR 00-013). Plant Physiol, 122, 2000, s. 292.
23.    STANCEV, N.Z., STUHNE-SEKALEC, L.: On the mechanism of enzymatic phosphatidylation. Biosynthesis of cardiolipin catalyzed by phospholipase D. Biochim Biophys Acta, 210, 1970, s. 350 – 352.
24.    GOTTLIN, E.B., RUDOLPH, A.E., ZHAO, Y.,
MATTHEWS, H.R., DIXON, J.E.: Catalytic mechanism of the phospholipase D superfamily proceeds via covalent phosphohistidine intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1998, s. 9202 – 9207.
25.    HOLBROOK, P. G., PANNELL, L. K., DALY, J. W.: Phospholipase D-catalyzed hydrolysis of phosphatidyl­choline occurs with P-O bond cleavage. Biochim Biophys Acta, 1084, 1991, s. 155 – 158.
26.    STUCKEY, J. A., DIXON, J. E.: Crystal structure of a phospholipase D family member. Nature Struct Biol, 6, 1999, s. 278 – 284.
27.    LEIROS, I., SECUNDO, F., ZAMBONELLI, C., SERVI, S., HOUGH, E.: The first crystal strucure of a phospholipase D. Structure Fold Des, 8, 2000, s. 655 – 657.
28.    ABERGEL, CH., ABOUSALHAM, A., CHENIVESSE, S., RIVIERE, M., MOUSTACAS-GARDIES, A.M., VERGER, R.: Crystallization and preliminary crystallographic study of a recombinant phospholipase D from cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.). Acta Crystal D Biol Crystal, 57, 2001, s. 320 – 322.

Skratky:

• HKD – histidín-lyzín-aspartát, CL – kardiolipín,
• NAPE – N-acylfosfatidyletanolamín, PA – kyselina fosfatidová,
• PC – fosfatidylcholín, PE – fosfatidyletanolamín,
• PG – fosfatidylglycerol, PI – fosfatidylinozitol,
• PIP2 – fosfatidylinozitol-4,5-difosfát, PLA2 – fosfolipáza A2,
• PLC – fosfolipáza, PLD – fosfolipáza D, PS – fosfatidylserín,

M. OBLOŽINSKÝ, L. BEZÁKOVÁ
Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv, Farmaceutická fakulta, UK,  Bratislava

MOLECULAR-BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF PLANT PHOSPHOLIPASES D

The review article summarizes the knowledge on molecular-biological characterization of plant phospholipases D (PLD, EC 3.1.4.4). This enzyme plays an important role in signal transduction processes. Recently, PLD has attracted much attention because of the study of membrane phospholipids and phospholipases functions in cellular regulation. The paper focuses the PLD isoforms, in respect to their catalytic activity and substrate specifity. Also, the problem of molecular strucutre is developed.
Keywords: Phospholipase D – isoenzymatic forms – catalytic activity – substrate specifity

• P. Mučaji, A. Vachálková, K. Kozics, Z. Krajčovičová, M. Nagy, D. Grančai, M. Haladová, E. Eisenreichová
• Štúdium potenciálnej karcinogénnej A cytotoxickej aktivity saponínov izolovaných z Lilium candidum L. a Cynara cardunculus L.
• Farm Obz, 79, 2010. 6, s. 147-152

Predložená práca opisuje potenciálnu karcinogénnu a cytotoxickú aktivitu steroidného saponínu z Lilium candidum L. a triterpénových saponínov z Cynara cardunculus L. Vzorky vykazujú veľmi nízku hodnotu parametra potenciálnej karcinogénnej aktivity, ktorá bola študovaná metódou DC polarografie v prítom­nosti kyseliny ?-lipoovej. Vysoká inhibičná aktivita týchto látok proti nádorovému promótoru

12-O-tetradekanoylforbol-13-acetátu v prítomnosti alebo bez prítomnosti dokázaného karcinogénu dimetylbenz[a]antracénu sledovaná metódou DC polarografie potvrdzuje, že testované látky môžu byť významnými inhibítormi malígnej transformácie buniek a tumorového rastu.

Protektívny účinok testovaných saponínov proti poškodeniu DNA indukovanom peroxidom vodíka v bunkových líniách L1210 a K562 metódou jednobunkovej gélovej elektroforézy nebol preukázaný. Testované saponíny zároveň nevykazovali v danom systéme cytotoxicitu.

Kľúčové slová: Lilium candidum L.­? Cynara cardunculus L. – saponíny – cytotoxicita – antimutagenita

Rastliny s obsahom saponínov sa v súčasnosti intenzívne študujú z hľadiska identifikácie obsahových látok, stanovenia ich obsahu a štúdia ich biologických účinkov. Tieto sekundárne metabolity sa vyznačujú širokým spektrom zaujímavých účinkov zistených v experimentoch in vitro, alebo in vivo, medzi ktorými bol pozorovaný protitumorový, chemopreventívny, antimutagénny, protizápalový, imunomodulačný, proti­vírusový účinok a mnohé iné (1 – 3). Problematika štúdia saponínov je zložitá vzhľadom na ich veľkú štrukturálnu rozmanitosť danú rozdielnosťou aglykónov a sa­charidových reťazcov. To určuje predpoklady na vznik veľkého počtu týchto zlúčenín, často s mi­nimálnymi zmenami v štruktúre a v polarite a kom­plikuje ich izoláciu.

Väčšinu prípravkov s obsahom saponínov tvoria rastlinné extrakty, alebo prečistené zmesi saponínov. V mnohých prípadoch ich presné zloženie nie je známe a nemožno ani vzťahovať účinok prípravku na konkrétny saponín (aj vzhľadom na možné antagonistické pôsobenie jednotlivých saponínov prítomných v zmesi), čo spôsobuje problémy pri štandardizácii produktov. Preto poznanie zloženia jednotlivých rastlinných extraktov, alebo zmesí saponínov a ich účinkov sa javí ako významný faktor na použitie a bezpečnosť fytopreparátov.

Predložená práca sa zaoberá štúdiom potenciálnej karcinogénnej, resp. inhibičnej aktivity saponínu z Lilium candidum L. (vzorka 1) a cynarasaponínov A a H (vzorka 2) z Cynara cardunculus L. Sledovaná aktivita látok bola stanovená metódou DC polaro­grafie. Potenciálna karcinogenita bola testovaná v prítomnosti kyseliny ?-lipoovej (LA), ktorá bola použitá ako mediátor karcinogenézy, resp. ako ukazovateľ schopnosti testovaných látok navodiť karcinogénne procesy. Inhibičná aktivita bola stano­vená v experimentoch so špecifickým promótorom epidermálnej karcinogenézy pri myšiach, 12-O-tetra­dekanoylforbol-13-acetátom (TPA), a to v prítomnosti, alebo bez prítomnosti dokázaného chemického karcinogénu 7,12-dimetylbenz[a]antracénu (DMBA).

Materiál a metódy

Použité chemikálie

N,N-dimetylformamid (DMF), extra suchý (Acros Organics, USA). Tetrabutylamónium perchlorát (TBAP) použitý v DC polarografických experimentoch ako základný elektrolyt pri koncentrácii 0,15 mol-1 (Fluka, Chemie AG, Švajčiarsko). Kyselina ?-lipoová (kyselina D,L-6,8 tiooktová) (Koch Light Laboratories, UK) a TPA, DMBA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemecko).

Chemikálie použité pri jednobunkovej gélovej elektroforéze (SGCE) Triton X-100, NMP agaróza (normal melting point), etídium bromid p. a., dimetylsulfoxid (DMSO), H2O2 (30%) p. a. (Sigma-Aldrich Chemie, GmbH, Ne­mecko). LMP agaróza (low melting point), RPMI-1640 médium bez L-glutamínu, NaHCO3 (Amresco-Biotechnology Grade, USA). Na2EDTA p. a., NaOH p. a., NaCl p. a. (Slavus, spol. s r. o., Slovenská republika). Tris(hydroxymetyl)-amínometan (Tris) p.a. (Serva Feinbiochemica, Nemecko). Roztok trypánovej modrej (TM) (0,4 %) p. a. (Fluka Chemie AG, Švajčiarsko). Fosfátový tlmivý roztok (PBS) (Oxoid, Anglicko). Fetálne bovinné sérum (FCS), amfotericín B, peni­cilín a streptomycín (PAN Biotech GmbH, Nemecko).

Polarografické podmienky

Všetky polarografické merania sa realizovali na prístroji PA 4 v spojení so zapisovačom údajov XY 4106 (Laboratorní přístroje Praha, CZ).

Experimenty sa robili v polarografickej nádobke prispôsobenej na prácu v bezvodnom prostredí. Ako indikačná elektróda bola použitá ortuťová kvapková elektróda s časom kvapky 3 s a prietokovou rýchlosťou 2,27 mg.s-1 pri výške ortuťového stĺpca hHg 81 cm. Ako referenčná elektróda sa použila nasýtená kalomelová elektróda (NKE) prispôsobená pre prácu v bezvodnom prostredí a ako pomocná elektróda sa použila plati­nová elektróda. Všetky polarografické merania sa realizovali v prísne inertnej atmosfére sušeného dusíka pri laboratórnej teplote, aby sa zamedzilo prístupu kyslíka a vlhkosti do polarografickej nádobky.

Parameter potenciálnej karcinogénnej aktivity testovaných látok bol stanovený na základe tvorby komplexov študovaných látok s LA. Kritériom hodnotenia potenciálnej karcinogenity bola hodnota difúzneho prúdu týchto komplexov. Potenciálna inhibičná aktivita sa stanovila na základe poklesu hodnôt difúzneho prúdu pozorovaných s nádorovým promótorom TPA v prítomnosti, alebo bez prítomnosti DMBA. Inhibičná aktivita sa vyjadrila ako percento pôvodne nameraného prúdu.

Protektívny účinok saponínovproti poškodeniu DNA

Protektívny účinok saponínov z Lilium candidum L. a Cynara cardunculus L. proti poškodeniu DNA indukovanom H2O2 bol stanovený na bunkových líniách L1210 a K562 metódou jednobunkovej gélovej elektroforézy (SCGE).

Bunkové kultúry: Myšia leukemická bunková línia L1210 a ľudská erytroleukemická bunková línia K562 sa získala od American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Bunky sa kultivovali v RPMI 1640 médiu obohatenom 10% fetálnym teľacím sérom ošetreným antibiotikami (penicilín 100 µg/ml, streptomycín 100 µg/ml). Bunky sa inkubovali pri 37 oC v atmosfére 5 % CO2 : 95 % vzduch. Experimenty sa uskutočnili v exponenciálnej fáze bunkového rastu. Cytotoxicita testovaných látok sa stanovila pri koncentrácii 50, 100 a 500 µM.

SCGE: Bunky sa inkubovali so saponínmi pri troch rôznych koncentráciách (50, 100 a 500 µM) počas 30 minút pri 37 oC. Jedna vzorka v každej skupine bola vždy kontrolná. Po uplynutí inkubačného času sa bunky centrifúgovali pri 1000 x g 5 min pri 25 oC. Potom sa bunky premyli tlmivým roztokom PBS a sedimentovali pri 1000 x g pri 25 oC 5 minút. Peletované bunky sa resuspendovali v 0,75% agaróze II (low-melting point) a preniesli na mikroskopické sklíčka pokryté 100 µl 1% agarózou I pripravenou v PBS bez prítomnosti Ca2+ a Mg2+. Na takto pripra­vené sklíčka sa pridalo 50 µl 100 µM H2O2 po dobu 5 minút. Následne sa bunky 2x premyli PBS a umiest­nili v lýzovacom roztoku (2,5 M NaCl, 100 mM

Na2 EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, pH 10) na 1 h pri +4 oC z dôvodu odstránenia proteínov. Takto pripra­vené vzorky sa preniesli do elektroforetického roztoku (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA, pH 13) na 40 minút pri 4 oC.

Prúd 25 V (300 mA) sa následne aplikoval 30 minút. Vzorky sa neutralizovali Trisom (0,4 mM, pH 7,5) a farbili 20 µl etídium bromidu 91 mg/ml). Zafarbené jadrá sa vyhodnotili fluorescenčným mikroskopom Zeiss Jenalumar (program Komet 3.0, Kinetic Imaging, Ltd., Liverpool, UK). Percentá DNA vo chvoste kométy sú lineárne úmerné frekvencii poškodení DNA. Výsledky sa štatisticky vyhodnotili Studentovým t-testom.

Izolácia látok z rastlinného materiálu

Izolácia saponínov z rastlinného materiálu je opísaná v literatúre (4, 5). Štruktúry izolátov sú znázornené na obrázku 1 a 2. Vzorka 2 sa izolovala a testovala ako zmes bidezmozidových saponínov v pomere 1 : 1 (cynarasaponín A a cynarasaponín H), odvodených od kyseliny ursolovej, resp. oleánolovej

Výsledky

• Tabuľka 1. Hodnoty polvlnového potenciálu (E1/2) a parameter karcinogenity (tg ?) pre vzorky 1 a 2
• 
  Vzorka    E1/2 /V/I.    E1/2/V/II    E1/2/V/compl.    tg?
• 1    -2,040    -2,450    -1,380    0,014
• 2    -2,095    -2,460    -1,380    0,014
• Tabuľka 2. Stanovenie inhibičnej aktivity vzoriek 1 a 2 oproti nádorovému promótoru TPA a TPA v kombinácii s DMBA (TPA+DMBA) polarografickou metódou.
• 
  Vzorka    I.A. [TPA] %1    I.A. [TPA+DMBA] %2
• 1    75    73
• 2    56    52
• 1 Inhibičná aktivita oproti TPA
• 2 Inhibičná aktivita oproti TPA za prítomnosti DMBA

Diskusia

K základným charakteristikám každej chemickej zlúčeniny patrí elektrochemická aktivita, t. j. schopnosť látky vstupovať do reakcií (redukcia/oxidácia). Elektrochemické vlastnosti testovaných látok sme študovali v prostredí prísne bezvodného DMF metódu DC polarografie. Všetky študované saponíny boli za daných experimentálnych podmienok stabilné v zá­vislosti od teploty a času a ich kalibračné závislosti boli v danom experimentálnom systéme v dostatočnom koncentračnom rozpätí lineárne. Za daných experimentálnych podmienok sa redukovali v dvoch veľmi dobre definovaných stupňoch (tabuľka 1). Hodnota polvlnového potenciálu prvej polarografickej vlny bola pri obidvoch testovaných zlúčeninách nižšia ako –2,00 V vs. NKE. Vzorka 1 bola redukovaná v prvom stupni redukcie pri potenciáli, ktorý bol o 50 mV pozitívnejší ako pri vzorke 2. Druhý polarografický stupeň bol takmer identický pre obidve vzorky.

Potenciálna karcinogénna aktivita steroidného saponínu z Lilium candidum L. a triterpénových saponínov z Cynara cardunculus L. sa stanovovala metódou DC polarografie v prítomnosti kyseliny ?-lipoovej (LA). LA ovplyvňuje v nevodnom prostredí pravdepodobne vďaka štruktúrnym predpokladom a transportným vlastnostiam polarografickú redukciu zlúčenín vyznačujúcich sa karcinogénnou aktivitou (6 – 8). Pri polarografickej redukcii karcinogénnych zlúčenín v prítomnosti LA dochádza ku vzniku novej polarografickej vlny, ktorá je pravdepodobne výsled­kom vzájomnej interakcie karcinogénu s LA. Táto novovzniknutá vlna má difúzny a reverzibilný cha­rakter a jej výška je priamo úmerná koncentrácii LA v roztoku. Veľkosť nárastu prúdových hodnôt novej vlny je charakterizovaný parametrom tg?, ktorého hodnota sa líši v závislosti od karcinogénnej aktivity zlúčenín. Látky, ktoré sa nevyznačujú karcinogénnou aktivitou, v prítomnosti LA novú polarografickú vlnu neposkytujú.

Nami študované zlúčeniny tvorili v prítomnosti LA reverzibilný komplex prejavujúci sa vznikom novej polarografickej vlny, ale hodnota difúzneho prúdu tohto komplexu, ktorá bola kritériom hodnotenia potenciálnej karcinogenity, bola veľmi nízka (cca. 10-1 µA).

Inhibičná aktivita zlúčenín bola študovaná metódou DC polarografie v prítomnosti nádorového promótora 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetátu, ktorý je špeci­fickým promótorom epidermálnej karcinogenézy a aj v prítomnosti dokázaného karcinogénu 7,12-di­metylbenz[a]antracénu (DMBA). Metóda stanovenia potenciálnej inhibičnej aktivity je založená na sledovaní poklesu hodnôt difúzneho prúdu polarografických vĺn v prítomnosti študovanej látky. Táto inhibícia je vyjadrená v percentách ako rozdiel hodnôt difúzneho prúdu nameraných pre promótor samotný, resp. v prítomnosti karcinogénu po pridaní testovaných látok (tabuľka 2). Z experimentov in vivo je známe, že TPA a DMBA majú synergický účinok (9 -- 10). Pri potieraní kože experimentálnych zvierat roztokom DMBA a po viacnásobnej aplikácii TPA sa zvýšil vý­skyt kožných papilómov z 89 % na 100 percent. Polarografická vlna DMBA sa v prítomnosti TPA zvyšuje o takmer 92 percent. Toto zistenie je v súlade s experimentami na zvieratách a ukazuje na možnosť za určitých podmienok simulovať biologický experiment.

Obe látky však vykazovali veľmi nízku potenciálnu karcinogenitu študovanú metódou DC polarografie v prítomnosti kyseliny ?-lipoovej. Vysoká inhibičná aktivita týchto látok v procese viacstupňovej karcinogenézy sledovaná metódou DC polarografie oproti nádorovému promótoru 12-O-tetra­dekanoyl­forbol-13-acetátu v prítomnosti, alebo bez prítomnosti dokázaného karcinogénu dimetylbenz[a]antracénu potvrdzuje, že testované látky by mohli byť význam­nými inhibítormi malígnej transformácie buniek a tumorového rastu. Inhibičná aktivita vzorky 2 je nižšia ako vzorky 1, čo môže byť dané rozdielnou štruktúrou sledovaných látok, ale aj skutočnosťou, že v prípade vzorky 2 ide o zmes látok, pri ktorých môže dochádzať k určitému antagonizmu medzi prítomnými zlúčeninami. Samotná kyselina ursolová na rozdiel od kyseliny oleánolovej účinne inhibovala vznik kožných nádorov v myšiach po použití nádorového promótora TPA (11). Zistené výsledky si však vyžadujú ďalšie overenie v systéme in vivo a in vitro.

Z literatúry je známy protektívny účinok triterpénových saponínov z Hedera helix na HepG2 bunky proti genotoxicite vyvolanej peroxidom vodíka v teste jednobunkovej gélovej elektroforézy (komet test) (12). Sledovaný protektívny účinok saponínov proti poškodeniu DNA na bunkových líniách L1210 a K562 spomínanou metódou znázorňuje graf 1. Študovaná bola aj cytotoxicita uvedených saponínov pri koncentráciách 50, 100 a 500 µM, keďže je známe, že saponíny izolované z rastlín čeľade Liliaceae vykazujú cytotoxickú aktivitu na bunkových líniách HL-60 L1210 (13). Testované saponíny v žiadnej z použitých koncentrácií nevykázali v danom testovacom systéme cytotoxicitu.

Protektívny účinok testovaných saponínov na poškodenie DNA peroxidom vodíka nebol preukázaný. O veľmi malej miere tohto účinku by sa dalo uvažovať len pri vzorke 1 v najvyššej použitej koncentrácii (500 µM).

Potenciálna antimutagénna aktivita saponínov z Cy­nara cardunculus L. bola testovaná na bunkách Euglena gracilis. Ako vyplýva z výsledkov, cynarasaponíny majú ochranný účinok proti poškodeniu chloroplastovej DNA prostredníctvom akridínovej oranžovej alebo ofloxacínu a znižujú počet vzniknutých bielych kolónií v závislosti od použitej koncentrácie (14).

Ofloxacín pôsobí ako inhibítor gyrázy (15) a je tvorcom reaktívnych kyslíkových radikálov (16, 17). Keďže pri testovaných cynarasaponínoch sa neprejavil ochranný účinok na poškodenie buniek vyvolaný peroxidom vodíka, na zistenom antimutagénnom účinku sa pravdepodobne podieľajú iné mechanizmy. Z literatúry je známe, že napr. kyselina ursolová pôsobí ako scavenger superoxidových radikálov v bunkových systémoch, zatiaľ čo v systémoch in vitro sa takáto aktivita nepozorovala (18). Pri steroidných saponínoch z Anemarrhena asphodeloides (Liliaceae) sa tiež pozoroval inhibičný účinok na produkciu superoxidových radikálov v polymorfonukleárnych leukocytoch získaných od zdravých darcov (19). Presný mecha­nizmus tohto pôsobenia nebol vysvetlený, ale je možné, že dochádza k ovplyvneniu fázy I metabolizujúcich enzýmov (=cytochrómu P450), alebo k indukcii fázy II metabolizujúcich enzýmov ako napr. glutatión S-transferázy alebo glutatión peroxidázy a k ovplyv­neniu antioxidačných obranných mechanizmov bunky (20).

Práce v posledných rokoch potvrdzujú, že saponíny izolované z rôznych rastlinných zdrojov majú široké spektrum perspektívnych biologických účinkov v testoch in vitro a in vivo. Veľmi dôležitou sa ukazuje otázka ich toxicity vzhľadom na široký výskyt v rastlinách používaných ako zelenina. Množstvo saponínov prijímané potravou je rôzne. Kým v prie­mernej rodine vo Veľkej Británii denný príjem saponí­nov je 15 mg na osobu, vegetariáni majú denný príjem 110 mg a „Aziati“ – vegetariáni prijímajú až 214 mg saponínov denne. Perorálna toxicita saponínov pre teplokrvné živočíchy je nízka a hodnota LD50 je v rozmedzí 50 – 1000 mg/kg. Dôvodom tejto nízkej toxicity je, že perorálne podávané saponíny sa obyčajne nevstrebávajú, a preto ani nepôsobia toxicky, ale ako vedľajšie obsahové látky v drogách môžu napomáhať vstrebávaniu hlavnej účinnej obsahovej látky (21).

Saponíny pravdepodobne tvoria nerozpustné komplexy s cholesterolom v tráviacom trakte s ná­sledným vylučovaním stolicou, alebo môžu ovplyvňo­vať metabolizmus cholesterolu napr. zvýšeným vylučovaním žlčových kyselín. Schopnosť saponínov reagovať s cholesterolom membrán môže však mať za následok aj zvýšenie permeability tenkého čreva a absorbciu antigénov spôsobujúcich rôzne zápalové a alergické reakcie. Taktiež môžu znižovať absorbciu živín, keďže sa viažu na žlčové kyseliny a týmto spôsobom ovplyvňujú príjem vitamínov A a E (22).

Parenterálna aplikácia má oveľa dramatickejší priebeh s hemolýzou, poškodením pečene, poruchami dýchania (krvácanie do alveol), kŕčmi až kómou. Hemolýza je spôsobená schopnosťou saponínov viazať sa na cholesterol membrán s porušením ich integrity a vytvorením pórov, čo je spojené s únikom elektrolytov.

Otázka dlhodobej konzumácie saponínov môže priniesť aj určité riziká, dobre ilustrované na príklade sladkovky hladkoplodej, pri ktorej takáto konzumácia môže vyvolať hypertenziu, hypokalémiu, poruchy srdcovej činnosti a hyperprolaktinémiu s amenoreou. Známky predávkovania saponínmi sa prejavujú masívnou saliváciou, hnačkami, nechutenstvom a príznakmi paralýzy, ale prípady s letálnym koncom sú zriedkavé – aj keď boli zaznamenané (21).

Nové možnosti testovania biologických aktivít využívajúce rôzne enzýmy alebo nádorové bunkové línie poukazujú na možnosť pozitívneho ovplyvnenia zápalov, imunitného systému alebo nádorových procesov saponínmi, avšak mechanizmy ich účinkov na molekulovej úrovni však stále zostávajú nevysvetle­né vo veľkej väčšine prípadov. Preto ďalší výskum zameraný na vysvetlenie týchto mechanizmov, potvrdenie už zistených účinkov, ale aj hľadanie no­vých alebo synteticky obmenených molekúl s lepšími biologickými vlastnosťami, môže v budúcnosti pomôcť nájsť racionálny základ na používanie saponínov v terapeutickej praxi.

Poďakovanie: Práca vznikla pri riešení grantových projektov VEGA č. 1/4289/07 a č. 2/5052/25

Literatúra

1.    Lacaille-Dubois, M. A., Wagner, H.: A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, 2, 1996, s. 363 – 386
2.    Hostettmann, K., Marston, A.: Saponins. Cambridge University Press, 1995, s. 230 – 300
3.    Balandrin, M. F.: Commercial utilization of plant derived saponins: an overview of medicinal, pharmaceutical and industrial applications. Saponins used in traditional and modern medicine. Plenum Press, New York, 1996, s. 1 – 13.
4.    Haladová, M., Eisenreichová, E., Mučaji, P., Buděšínský, M., Ubik, K.: Steroidal saponins from Lilium candidum L. Collect Czech Chem Commun, 63, 1998, s. 205 – 210.
5.    Mučaji, P., Grančai, D., Nagy, M., Buděšínský, M., Ubik, K.: Triterpenoid saponins from Cynara cardunculus L. Pharmazie, 54, 1999, s. 714 – 716.
6.    Novotný, L., Vachálková, A.: Some electrochemical characteristics of synthetic analogs of nucleic acid components. I. Derivatives of cytidine and arabinosylcytosine. An attemptto find correlation among some of their properties. Neoplasma, 37, 1990, s. 377 – 386.
7.    Novotný, L., Vachálková, A., Pískala, A.: Investigation of polarographic properties and potential carcinogenity of some hydroxyurea derivatives by DC polarography. Collect Czech Chem Commun, 61, 1996, s. 656 – 662.
8.    Novotný, L., Vachálková, A., Pískala, A.: Investigation of polarographic properties and potential carcinogenity of some natural nucleosides and their synthetic analogues. Bioelectrochem Bioenergetics, 50, 1999, s. 129 – 134.
9.    Kaminaga, T., Yasukawa, K., Kanno, H., Tai, T., Nunoura, Y., Takido, M.: Inhibitory effects of lanostane-type triterpene acids, the components of Poria cocos, on tumor promotion by 12-O-tetraphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Oncology, 53, 1996, s. 382 – 385.
10.    Yasukawa, K., Akihisa, T., Oinuma, H., Kaminaga, T., Kanno, H., Kasahara, Y., Tamura, T., Kumaki, K., Yamanouchi, S., Takido, M.: Inhibitory effect of taraxane-type triterpenes on tumor promotion by 12-O-tetraphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Oncology, 53, 1996, s. 341 – 344.
11.    Ovesná, Z., Vachálková, A., Horváthová, K., Tóthová, D.: Pentacyclic triterpenoic acids: new chemoprotective compounds. Neoplasma, 51, 2004, s. 327 – 333.
12.    Mba Gachou, C., Laget, M., Guiraud-Dauriac, H., De Méo, M., Elias, R., Duménil, G.: The protective activity of ?-hederine against H2O2 genotoxicity in HepG2 cells by alkaline comet assay. Mutat Res, 445, 1999, s. 9 – 20.
13.    Mimaki, Y., Yokosuka, A., Kuroda, M., Sashida, Y.: Cytotoxic activities and structure- cytotoxic relationships of steroidal saponins. Biol Pharm Bull, 24, 2001, s. 1286 – 1289.
14.    Križková, L., Mučaji, P., Nagy, M., Krajčovič, J.: Triterpenoid cynarasaponins from Cynara cardunculus L. reduce chemically induced mutagenesis in vitro. Phytomedicine, 11, 2004, s. 673 – 678.
15.    Hooper, D.C., Wolfson, J.S.: Mechanisms of quinolone action and bacterial killing. In: Quinolone Antimicrobial Agents, 2nd edn., (Eds. Hooper, D. C. and Wolfson, J. S.) American Society for Microbiology, Washington DC, 1993, s. 53.
16.    Ebringer, L., Dobias, J., Krajčovič, J., Polónyi, J., Križková, L., Lahitová, N.: Antimutagenes reduce ofloxacin-induced bleaching in Euglena gracilis. Mutat Res, 359, 1996, s. 85 – 93.
17.    Križková, L., Nagy, M., Polónyi, J., Ebringer, L.: The effect of flavonoids on ofloxacin-induced mutagenicity in Euglena gracilis. Mutat Res, 416, 1998, s. 85 – 92.
18.    Ali, M. S., Ibrahim, S. A., Jalil, S., Choudhary, M. I.: Ursolic acid: a potent inhibitor of superoxides produced in the cellular system. Phytother Res (in press-published online: 13 Feb 2007)
19.    Meng, Z.Y., Zhang, J.Y., Xu, S.X., Sugahara, K.: Steroidal saponins from Anemarrhena asphodeloides and their effects on superoxide generation. Planta Med, 65, 1999, s. 661 – 663.
20.    Galati, G., O´Brien, P.J.: Potential toxicity of flavonoids and other dietary phenolics: significance for their chemopreventive and anticancer properties. Free Rad Biol Med, 37, 2004, s. 287 – 303.
21.    Hostettmann, K., Marston, A.: Saponins. Cambridge University Press 1995.
22.    Cheeke, P.R.: Biological effects of feed and forage saponins and their impacts on animal production. In: Saponins used in food and agriculture (Eds.: Waller, G. R., Yamasaki, K.), Plenum Press New York 1996, s. 377.

P. Mučaji, A. Vachálková, K. Kozics, Z. Krajčovičová, M. Nagy, D. Grančai, M. Haladová, E. Eisenreichová
Katedra farmakognózie a botaniky, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava
Ústav experimentálnej onkológie, SAV, Bratislava

SUMMARY

P. Mučaji, A. Vachálková, K. Kozics, Z. Krajčovičová, M. nagy, D. Grančai, M. Haladová, E. Eisenreichová

Study of carcinogenic and cytotoxic activity of saponins isolated from Lilium candidum L. and Cynara cardunculus L.

The paper deals with determination of potential carcinogenic and inhibitory activity of the saponins isolated from Lilium candidum L. and Cynara cardunculus L. Samples showed very low potential carcinogenity performed by DC polarography in the presence of ?-lipoic acid. High inhibitory activity against the tumor promoter TPA in the absence or presence of the carcinogen DMBA demonstrate, that these substances may serve as important inhibitors of malignant cellular transformation and tumor growth.
Protective effect of tested saponins against H2O2 caused damage of DNA was evaluated on L1210 and K562 cell lines by the single cell gell electrophoresis. Neither protective nor cytotoxic effect of used saponins was observed in both cell lines.
Key words: Lilium candidum L. ? Cynara cardunculus L. ? saponins ? cytotoxicity – antimutagenicity

• Šramko M., Remko M.
• Štúdium acidity vybraných inhibítorov angiotenzín konvertujúceho enzýmu
• Farm Obz, 79, 2010, 6, s. 139-146

Ab initio metódy elektrónovej hustoty boli použité na štúdium acidít piatich vybraných ACE inhibítorov v izolovanom stave. Acidity sú vyjadrené ako entalpia ?H298 a Gibbsova energia ?G298 deprotonácie pri teplote 298 K. Použitá bola dvojvrstvová ONIOM metóda, ktorá umožňila štúdium acidít vybraných ACE inhibítorov, presnejšou Becke3LYP metódou s bázou 6-311+G(d,p), zatiaľ čo zvyšné časti molekuly boli študované na úrovni Hartree-Fock s bázou 3 – 21G*. Študované ACE inhibítory sú slabé kyseliny s vypočítanými aciditami medzi 1290 – 1420 kJ.mol-1. Zo študovaných liečiv je najkyslejší v izolovanom stave aj vodnom roztoku spiraprilát.

Kľúčové slová: acidita – disociačná konštanta – ACE inhibítory – DFT metóda – SPARC

Inhibítory angiotenzín konvertujúceho enzýmu sú rýchlo sa vyvíjajúcou skupinou liečiv, ktorá má v súčasnosti široké terapeutické použitie. Uplatňujú sa najmä v terapii esenciálnej hypertenzie, post-infarktových stavoch, mestnavom zlyhaní srdca, pri diabete, ochoreniach obličiek a po mozgovej príhode (1 - 3). Tieto látky ovplyvňujú renínový-angiotenzíno­vý-aldosterónový systém (RAAS) ako kompetitívne inhibítory angiotenzín konvertujúceho enzýmu. Angiotenzín konvertujúci enzým (ACE; EC 3.4.15.1) je membránový glykoproteín typu I, ktorý je exprimo­vaný na povrchu epitelových a endotelových buniek. Je súčasťou RAAS (regulačný systém ľudského organizmu, ktorý zohráva významnú úlohu v regulácii krvného tlaku, patogenéze hypertenzie, a aj iných ochorení).

U ľudí rozoznávame dve rozdielne formy ACE: somatickú a testikulárnu. Somatická forma je zložená z 1306 aminokyselín a dvoch domén (N- a C-do­mény). Každá doména obsahuje aktívne miesto, v ktorom sa nachádza katión Zinku (Zn2+). Testikulár­ny ACE sa skladá zo 732 zvyškov a má jedno Zn2+ katión obsahujúce katalytické miesto, ktoré je homogénne s C-doménou somatickej formy (4, 5).

ACE katalyzuje dve reakcie, ktoré majú významnú úlohu pri regulovaní arteriálneho tlaku. Je to a) pre­mena angiotenzínu I, ktorý je neaktívny dekapeptid na angiotenzín II, oktapeptid s vysokou vazo­konstrikčnou aktivitou, b) degradácia nonapeptidu bradykinínu, ktorý je účinným vazodilatátorom. Nadviazaním ACE inhibítora do aktívneho miesta ACE sa teda súčasne zabráni tvorbe vazokonstrikčne pôsobiaceho angio­tenzínu II a rozkladu vazoprotektív­ne pôsobiaceho bradykinínu. Zvýšená hladina bradykinínu podporuje syntézu vazodilatačne pôsobiacich NO a prostacyklínu PGI2. Znížením hladiny angiotenzínu II dôjde k zníženému uvoľňova­niu aldosterónu a zvýšenej nátriuréze. Všetky tieto mechanizmy v konečnom dôsledku znižujú tlak krvi. Okrem antihypertenzného účinku vykazujú inhibítory ACE aj vaskuloprotektívne a antitrombotické vlast­nosti, ktoré môžu zohrávať priaznivú úlohu pri kardiovaskulárnej morbidite (6, 7).

Disociácia liečiv zohráva významnú úlohu pri ich distribúcii v organizme a následnej väzbe na receptor. Z tohto dôvodu je dôležité poznať, či liečivo existuje za podmienok fyziologického prostredia v neutrálnej alebo ionizovanej forme. Študované ACE inhibítory obsahujú kyslé funkčné skupiny (karboxylovú –COOH a tiolovú -SH), ktoré sa vo vodných roztokoch môžu vyskytovať v ionizovanej, príp. protonizovanej forme, v závislosti od pH prostredia.

Prítomnosť dvoch kyslých funkčných skupín znižuje gastrointestinálnu absorpciu a biologickú dostupnosť. Aj preto sa väčšina používaných ACE inhibítorov zaraďuje medzi typické prodrug liečivá. To znamená, že v liekovej forme je neúčinný alebo málo účinný prekurzor (prodrug forma), ktorý má výhodnejšie farmakokinetické vlastnosti. Pri ACE inhibítoroch sa toto dosiahne esterifikovaním kyslejšej funkčnej skupiny, ktorá sa po absorpcii látky do organizmu ľahko hydrolyzuje pomocou nešpecifických hydroláz na príslušnú aktívnu formu (obr. 1). Aktívna forma sa potom viaže do aktívneho miesta enzýmu ACE. Na základe kryštalografických údajov sa predpokladá že funkčné skupiny inhibítora ACE nadviazaného v enzýme na katión zinku sú v ionizovanej forme.

Biologická aktivita ACE inhibítorov je spojená najmä s ich vysokou väzbovou kapacitou vzhľadom na katióny zinku v aktívnom mieste enzýmu (8, 9). Klinicky používané inhibítory ACE sa podľa väzby na katión zinku v aktívnom mieste zatrieďujú do troch skupín.

ACE inhibítory s obsahom tiolovej (napr. kaptopril), karboxylovej (napr. enalapril, perindopril) a fosfinylovej funkčnej skupiny (fosinopril). Aj keď majú spoločný molekulový mechanizmus účinku (inhibícia enzýmu konvertujúceho angiotenzín), bude ich výsledný farmakologický efekt daný špecifickými fyzikálno-chemickými, farmakokinetickými (absorpcia, distribúcia, metabolizmus a exkrécia) a toxickými vlastnosťami (10). Kyslosť v roztoku je ovplyvnená interakciami medzi rozpúšťanou látkou a rozpúšťad­lom. Môže nastať situácia, že poradie acidít jednotli­vých funkčných skupín študovaných vo vodnom prostredí nebude korelovať s aciditami študovanými v izolovanom stave. V plynnom stave sa totiž môžu výraznejšie prejaviť slabé intramolekulové sily, ktoré sú v roztokoch bežne vplyvom prostredia zoslabené (11, 12).

Úlohou tejto štúdie bolo preskúmať acidobázické vlastnosti piatich vybraných inhibítorov ACE (kapto­pril, enalaprilát, ramiprilát, spiraprilát a zofenoprilát). Na štúdium geometrie a acidity týchto látok v izolovanom stave sa použili DFT metódy (metódy elektrónovej hustoty). Vyjadrené sú ako Gibbsove energie deprotonácie pri teplote 298 K (?G298). Na vyjadrenie miery kyslosti študovaných látok v roztoku sme použili teoreticky vypočítané hodnoty pKa vo vodnom prostredí.

Metódy

Počiatočné geometrie študovaných látok boli namode­lované na základe predchádzajúcich konformačných štúdií (13 – 15). Preštudované boli viaceré konformácie pre každú látku v neutrálnej a v ionizovanej forme, na výpočet termodynamických parametrov sa však po­užili len najstabilnejšie konformácie.

Geometrie študovaných látok boli úplne optimalizované v programe Gaussian 98 (16) pomocou dvojvrstvej ONIOM metódy (17 – 19). ONIOM metóda umožňuje detailnejšie štúdium (na vyššej úrovni teórie) dôležitých častí molekulového systému, zatiaľ čo ostatné časti systému sú študované na výpočtovo prijateľnejšej úrovni pomocou nižšej úrovne teórie. Modelové systémy a reálne štruktúry použité pri ONIOM výpočtoch sú zobrazené na obr. 2. Reálne systémy pozostávajú z kompletných molekúl inhibí­torov a ich príslušných aniónov. Dve úrovne teórie použité na výpočet energií sú teória funkcionálu elektrónovej hustoty (DFT) (20,21) na úrovni Becke3LYP (22-24) s bázou 6-311+G(d,p) (vyššia úroveň) a metóda Hartree-Fock s bázou 3-21G* pre nižšiu úroveň teórie.

Acidita v plynnej fáze ?E (A) bola definovaná ako energia deprotonácie ?E pre rovnicu:         (1)

Energia deprotonácie ?E, pri T = 0 K, bola počítaná pomocou rovnice:             (2)

kde E je celková energia stabilných konformácií kyseliny a jej aniónov. Použili sa extrapolované hodnoty ONIOM energií (EONIOM). Entalpia deprotonácie, ?H298 bola počítaná pomocou rovníc (3) a (4):             (3)   (4)

kde E298 predstavuje celkovú energiu stabilných konformácií kyselín a príslušných aniónov (vrátane tepelnej korekcie energie pri T = 298 K). V rovnici (3) sme nahradili ?(pV) = RT (v reakcii (1) bol získaný 1 mol plynu). Gibbsova energia deprotonácie ?G298 (acidita v plynnej fáze) bola počítaná pomocou rovnice:             (5)

Entropický príspevok bol definovaný ako:     (6)

Pre T = 298 K pri štandardnom tlaku možno nahradiť druhý člen TS(H+) = 32,5 kJ.mol-1, (25). Teda:    (7)

Potrebné je uvedomiť si nepriamu úmernosť medzi hodnotou ?G (acidita v plynnej fáze) a silou kyseliny. Čím je hodnota ?G vyššia, tým je kyselina slabšia. Na obr. 3 sú detailne zobrazené možné spôsoby disociácie študovaných molekúl. Je preukázané, že viacvrstvový ONIOM prístup poskytuje výbornú metódu presných výpočtov pre väčšie systémy (26 – 31). Pre takéto systémy sú zatiaľ presné výpočty často príliš nákladné a neuskutočniteľné. DFT a ab initio SCF výpočty sa uskutočnili pomocou programu Gaussian 98 (16).

Výpočty disociačnej konštanty pKa vo vodnom prostredí sme uskutočnili pomocou internetového softwaru SPARC (32). Program SPARC vyvinutý Carreirom a spol. (33, 34) počíta viaceré parametre chemickej reaktivity (ako ionizačná konštanta pKa, kinetika, výparné teplo, bod varu, difúzny koeficient a pod.), pričom používa výpočtové algoritmy založené na základoch chemickej štruktúrnej teórie. SPARC stojí používateľa len niekoľko minút výpočtového času, pričom poskytuje väčšiu presnosť aká môže byť s inými konvenčnými metódami (35).

Výsledky a diskusia

Konformácie s najnižšou energiou (energetické minimá) študovaných molekúl sú uvedené na obr. 4 v paličkovom zobrazení. Z dôvodu lepšej prehľadnosti sú zobrazené len tie atómy vodíka, ktoré sú súčasťou funkčných disociačných skupín. Všetky optimalizo­vané štruktúry boli podrobené vibračnej frekvenčnej analýze. Nenašli sa žiadne imaginárne frekvencie, takže uvedené štruktúry reprezentujú skutočné mi­nimá v izolovanom stave.

Študované ACE inhibítory obsahujú kyslé funkčné skupiny (karboxylovú –COOH a tiolovú –SH), ktoré sú schopné podliehať deprotonačným reakciám. Známe je, že do aktívneho miesta enzýmu ACE sa študované látky viažu vo forme aniónu, ktorý teda predstavuje aktívnu formu inhibítora (1, 36, 37).

Vypočítané hodnoty acidít v izolovanom stave pri štandardnej teplote 298 K (deprotonačné entalpie ?H298 a Gibbsove energie ?G298) pre ionizáciu do prvého i druhého stupňa sú uvedené v tab. 1. Hodnoty acidít niektorých ACE ihibítorov v izolovanom stave už boli vypočítané teoretickými metódami (14, 15). Disociačná konštanta, resp. hodnota pKa je mierou sily kyseliny alebo zásady v roztoku. Z toho dôvodu je tento pa­ramer veľmi nápomocný na porozumenie správania sa liečiva v mieste účinku, čiže v aktívnom mieste receptora. Doposiaľ jediné publikované experimen­­-tálne hodnoty týkajúce sa disociácie ACE inhibítorov vo vodnom prostredí sú hodnoty pKa pre kaptopril, lisinopril a enalapril. Experimentálna hodnota pKa pre non-prodrug inhibítor kaptopril je 3,7 pre C-terminálny karboxyl a 9,8 pre tiolovú skupinu (pri pH = 7 nebude teda tiolová skupina disociovaná) (14, 38). Expe­rimen­tálna hodnota pKa pre inhibítor enalapril (N-terminál­ny etyl-ester enalaprilátu) je 3,0 pre C-terminálnu karbo­xylovú skupinu (39, 40). Vypočíta­né hodnoty disociačnej konštanty pKa vo vodnom pro­stre­dí pomocou programu SPARC sú uvedené v tab. 2.

V prípade kaptoprilu sú hodnoty deprotonácie ?H298 a ?G298 pre N-terminálnu tiolovú skupinu vyššie o 66,5 a 63,1 kJ.mol-1 ako pre C-terminálnu karboxylovú skupinu. To naznačuje, že C-terminálna karboxylová skupina je podstatne kyslejšia ako tiolová skupina. Rovnaký trend sme pozorovali aj vo vodnom prostredí. Vypočítané pKa hodnoty pomocou softvéru SPARC takisto naznačujú, že C-terminálna karboxylová sku­pina (pKa = 4,49) je podstatne kyslejšia ako tiolová skupina (pKa = 9,54).

V prípade enalaprilátu je vypočítaná Gibbsova energia deprotonizácie ?G298 pre N-terminálnu karboxylovú skupinu o 13,4 kJ.mol-1 nižšia v porovnaní s C-terminálnou karboxylovou skupinou, čo naznačuje že N-terminálna karboxylová skupina je mierne kyslejšia ako C-terminálna karboxylová skupina. Podobne vo vodnom prostredí sa na základe teoretic­kých pKa hodnôt javí N-terminálna karboxylová skupina (pKa = 2,03) kyslejšia v porovnaní s C-ter­minálnou karboxylovou skupinou (pKa = 4,09). Toto poradie kyslosti takisto vysvetľuje, prečo v prípade pro-drug foriem väčšiny inhibítorov ACE je N-terminál­na karboxylová skupina esterifikovaná etylovou skupinou. Pro-drug forma (etylester inhibítora) je lipofilnejšia a menej kyslá ako jej aktívna forma, a teda sa lepšie vstrebáva z gastrointestinálneho traktu.

Gibbsova energia deprotonácie pre N-terminálnu karboxylovú skupinu ramiprilátu v izolovanom stave je o 17,8 kJ.mol-1 nižšia v porovnaní s C-terminálnou karboxylovou skupinou, a podobne ako pri enalapriláte možeme usudzovať, že N-terminálna karboxylová skupina bude opäť mierne kyslejšia ako C-terminálna karboxylová skupina. Štruktúra inhibítora ramiprilátu je veľmi podobná štruktúre enalaprilátu. Líšia sa len prítomnosťou cyklopentánového kruhu nadviazaného na L-prolín. Aj to vysvetľuje rovnaké vypočítané hodnoty disociačnej konštanty pKa vo vodnom prostre­dí pri enalapriláte a ramipriláte.

V prípade spiraprilátu je vypočítaná Gibbsova energia deprotonizácie ?G298 pre N-terminálnu karboxylovú skupinu o 42,7 kJ.mol-1 nižšia v porovnaní s C-terminálnou karboxylovou skupinou, čo naznačuje že N-terminálna karboxylová skupina je kyslejšia ako C-terminálna karboxylová skupina. Takisto v roztoku na základe vypočítaných pKa hodnôt je N-terminálna karboxylová skupina (pKa = 1,93) kyslejšia v porovnaní s C-terminálnou karboxylovou skupinou (pKa = 3,75). Gibbsova energia deprotonácie pre N-terminálnu karboxylovú skupinu spiraprilátu v izolovanom stave je v porovnaní s N-terminálnou karboxylovou skupi­nou enalaprilátu o 43,5 kJ.mol-1 nižšia. N-terminálna karboxylová skupinu spiraprilátu v izolovanom stave je teda kyslejšia, čo koreluje aj s vypočítanými pKa hodnotami vo vodnom prostredí, kde sa N-terminálna karboxylová skupina spiraprilátu (pKa = 1,93) javí ako kyslejšia v porovnaní s N-terminálnou karboxylovou skupinou enalaprilátu (pKa = 2,03).

Gibbsova energia deprotonácie pre N-terminálnu tiolovú skupinu zofenoprilátu v izolovanom stave je o 52,7 kJ.mol-1 vyššia v porovnaní s C-terminálnou karboxylovou skupinou. Karboxylová skupina je teda aj v tomto prípade (podobne ako pri kaptoprile) kyslejšia, čo dobre koreluje aj s vypočítanými pKa hodnotami vo vodnom prostredí, kde C-terminálna karboxylová skupina (pKa = 4,2) je podstatne kyslejšia ako N-terminálna tiolová skupina (pKa = 9,42).

Záver

Deprotonáciou funkčných skupín študovaných inhibítorov došlo k zmene ich geometrií, a to najmä v blízkosti reakčných centier. Tiolové skupiny v ne­utrálnych molekulách kaptoprilu a zofenoprilátu vytvárajú intramolekulové vodíkové väzby s kyslíkom karbonylovej skupiny, deprotonáciou tiolovej skupiny však dochádza k silnej repulzii medzi karbonylovým kyslíkom a atómom síry, čo vedie ku konformačným zmenám. Entalpie a Gibbsove energie študovaných inhibítorov v izolovanom stave dobre korelujú s expe­rimentálnymi a teoretickými pKa hodnotami vypočí­tanými pomocou programu SPARC. Výsledky štúdie potvrdili opodstatnenosť chránenia kyslejšej N-termi­nálnej karboxylovej skupiny pri pro-drug ACE inhibítoroch hydrolyzovateľnou esterovou väzbou.

Najľahšie disociovateľnou kyslou funkčnou skupi­nou zo študovaných inhibítorov je N-terminálna karboxylová skupina spiraprilátu (Gibbsova energia deprotonácie ?G298 = 1297,3 kJ.mol-1). Najmenej kyslá funkčná skupina je N-terminálna tiolová skupina kaptoprilu s Gibbsovou energiou deprotonácie ?G298 = 1419,6 kJ.mol-1.

V tejto štúdii bola použitá dvojvrstvá ONIOM metóda, ktorá vykázala dobré výsledky s primeranými výpočtovými nákladmi a potvrdila sa jej použiteľnosť pri štúdiu väčších systémov, ktoré možno rozdeliť na menšie podsystémy.

Práca bola podporená grantom VEGA 1/4301/07, grantom Univerzity Komenského č. UK/42/2007 a  rantom ESF (kód ITMS: 13120200090)

Literatúra
1.    OPIE, L. H.: Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors, 2nd ed. Wiley-Liss: New York 1994.
2.    WONG, J., PATEL, R. A., KOWEY, P. R.: The Clinical Use of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors. Progress in Cardiovascular Diseases, 47, 2004, s. 116 – 130.
3.    NEAL., B., MACMAHON, S., CHAPMAN, N.: Effects of ACE inhibitors, calcium antagonist and other blood pressure lowering drugs. Lancet, 356, 2000, s. 1955 – 1964.
4.    HOOPER, N. M.: Families of zinc metalloproteases. FEBS Lett, 354, 1994, s. 1 – 6.
5.    HUBERT, C., HOUOT, A.-M., CORVOL, P., SOUBRIER, F.: Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. J Biol Chem, 266, 1991, s. 15377 – 15383.
6.    REMKOVÁ, A., KRATOCHVÍĽOVÁ H.: Effect of angiotensin converting enzyme inhibitor perindopril on haemostasis in essential hypertension. Blood Coagul Fibrinolysis, 11, 2000, s. 641 – 644.
7.    OKRUCKÁ, A., PECHÁŇ, J., KRATOCHVÍĽOVÁ, H.: Effect of angiotensin converting enzyme inhibitor perindopril on endothelial and platelet functions in essential hypertension. Platelets, 9, 1998, s. 63 – 67.
8.    SWAMY, K. M. K., LIN, M.-J., SUN, CH.-M.: Advances in Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors and Angiotensin Receptor Blockers. Mini Rev Med Chem, 3, 2003, s. 621 – 631.
9.    SMIEŠKO, M., REMKO, M.: Coordination and Thermodynamics of Stable Zn(II) Complexes in the Gas Phase. J Biomol Struct Dyn, 20, 2003, s. 759 – 769.
10.    REMKO, M.: Angiotenzín konvertujúci enzým. Farm Obzor LXXV, 2006, s. 107 – 112.
11.    AUE, D. H., WEBB, H. M., BOWERS, M. T.: Stabilities of Positive Ions from Equilibrium Gas-Phase Basicity Measurements. J Am Chem Soc, 98, 1976, s. 318 – 325.
12.    TUNON, I., SILLA, E., PASCUAL-AHUIR, J. L.: Theoretical Study of the Inversion of the Alcohol Acidity Scale in Aqueous solution. J Am Chem Soc 115, 1993, s. 2226 – 2230.
13.    SMIEŠKO, M., REMKO, M.: Preferred Conformation of Selected ACE Inhibitors for Interaction with ACE Active Site. Chem Pap, 56, 2002, s. 138 – 143.
14.    SMIEŠKO, M., REMKO, M.: Two-Layer ONIOM Calculation of Gas-Phase Acidities of Selected ACE Inhibitors. Chem Pap, 58, 2004, s. 71 – 78.
15.    ŠRAMKO, M., REMKO, M., GARAJ, V.: Theoretical Study of Gas-Phase Acidities of Selected Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors. Structural Chemistry 16, 2005, s. 391 – 399.
16.    Gaussian 98 (Revision A.7), FRISCH, M. J., TRUCKS, G. W., SCHLEGEL, H. B., SCUSERIA, G. E., ROBB, M. A., CHEESEMAN, J. R., ZAKRZEWSKI, V. G., MONTGOMERY, Jr., J. A., STRATMANN, R. E., BURANT, J. C., DAPPRICH, S., MILLAM, J. M., DANIELS, A. D., KUDIN, K. N., STRAIN, M. C., FARKAS, O., TOMASI, J., BARONE, V., COSSI, M., CAMMI, R., MENNUCCI, B., POMELLI, C., ADAMO, C., CLIFFORD, S., OCHTERSKI, J., PETERSSON, G. A., AYALA, P. Y., CUI, Q., MOROKUMA, K., MALICK, D. K., RABUCK, A. D., RAGHAVACHARI, K., FORESMAN, J. B., CIOSLOWSKI, J., ORTIZ, J. V., STEFANOV, B. B., LIU, G., LIASHENKO, A., PISKORZ, P., KOMAROMI, I., GOMPERTS, R., MARTIN, R. L., FOX, D. J., KEITH, T., AL-LAHAM, M. A., PENG, C. Y., NANAYAKKARA, A., GONZALEZ, C., CHALLACOMBE, M., GILL, P. M. W., JOHNSON, B., CHEN, W., WONG, M. W., ANDRES, J. L., GONZALEZ, C., HEAD-GORDON, M., REPLOGLE, E. S., and POPLE, J. A., GAUSSIAN, Inc., Pittsburgh PA, 1998.
17.    SVENSSON, M., HUMBEL, S., FROESE, R. D. J., MATSUBARA, T., SIEBER, S., MOROKUMA, K.: ONIOM: A Multilayered Integrated MO + MM Method for Geometry Optimizations and Single Point Energy Predictions. J Phys Chem, 100, 1996, s. 19357 – 19363.
18.    HUMBEL, S., SIEBEL, S., MOROKUMA, K.: The IMOMO Method: Integration of Different Levels of Molecular Orbital Approximations for Geometry Optimization of Large Systems. J Chem Phys, 105, 1996, s. 1959 – 1967.
19.    FROESE, R. D. J., MOROKUMA, K.: In Encyclopedia of Computational Chemistry, SCHLEYER, P. V. R., Ed., Wiley: New York, 1998.
20.    PARR, R. G., WANG, W.: Density-Functional Theory of Atoms and Molecules. Oxford University Press: New York, 1994.
21.    NEUMANN, R., NOBES, R. H., HANDY, N. C.: Exchange functionals and potentials. Mol Phys, 87, 1996, s. 1 – 36.
22.    BECKE, A. D.: Density-functional exchange-energy approximation with correct asymptotic behaviour. Phys Rev, A38, 1988, s. 3098 – 3100.
23.    BECKE, A. D.: Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. J Chem Phys, 98, 1993, s. 5648 – 5652.
24.    LEE, C., YANG, W., PAAR, R. G.: Development of the Colle-Salvetti correlation-energy formula into a functional of the electron density. Phys Rev, B37, 1988, s. 785 – 789.
25.    ALBERTY, R. A., SILBEY, R. J.: In Physical Chemistry, 2nd ed., Wiley: New York, 1997.
26.    REMKO, M., WALSH, O. A., RICHARDS, W. G.: Molecular structure and gas-phase reactivity of clonidine and rilmenidine. Chem Phys Phys Chem, 3, 2001, s. 901 – 907.
27.    REMKO, M., WALSH, O. A., RICHARDS, W. G.: Theoretical Study of Molecular Structure, Tautomerism, and Geometrical Isomerism of Moxonidine. J Phys Chem, A 105, 2001, s. 6926 – 6931.
28.    DAPPRICH, S., KOMAROMI, I., BYUN, K. S., MOROKUMA, K., FRISCH, M. J.: A New ONIOM Implementation in Gaussian 98. J Mol Struct Theochem, 1, 1999, s. 461 – 462.
29.    FROESE, R. D. J., MOROKUMA, K.: Accurate Calculations of Bond Breaking Energies in C60 Using the Three-layered ONIOM Method. Chem Phys Lett, 305, 1999, s. 419 – 424.
30.    VREVEN, T., MOROKUMA, K.: The Accurate Calculation and Prediction of the Bond Dissociation Energies in a Series of Hydrocarbons Using the IMOMO. J Chem Phys, 111, 1999, s. 8799 – 8803.
31.    REMKO, M., LYNE, P. D., RICHARDS, W. G.: Molecular structure and gas-phase reactivity of zileuton and its N-dehydroxylated metabolite: two-layered ONIOM calculations. Phys Chem Chem Phys, 2, 2000,
s. 2511 – 2514.
32.    http://ibmlc2.chem.uga.edu/sparc
33.    HILAL, S., KARICKHOFF, S. W., CARREIRA, L. A.:
A rigorous test for SPARC‘s chemical reactivity models. Quant Struct Act Rel, 14, 1995, s. 348 – 355.
34.    CARREIRA, L. A., HILAL, S., KARICKHOFF, S. W.: In Theoretical and Computational Chemistry, Quantitative Treatment of Solute/Solvent Interactions, POLITZER, P., MURRAY, J. S., Eds., Elsevier Publishers: Amsterdam, 1994.
35.    HILAL, S., KARICKHOFF, S. W., CARREIRA, L. A.: Estimation of Carboxylic Acid Ester Hydrolysis Rate Constants. QSAR Comb Sci, 22, 2003, s. 917 – 925.
36.    NATESH, R., SCHWAGER, S. L. U., STURROCK, E. D., ACHARYA, K. R.: Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex.
Nature, 421, 2003, s. 551 – 554.
37.    NATESH, R., SCHWAGER, S. L. U., EVANS, H. R., STURROCK, E. D., ACHARYA, K. R.: Structural details on the binding of antihypertensive drugs captopril and enalaprilat to human testicular angiotensin I-converting enzyme. Biochemistry 43, 2004, s. 8718 – 8724.
38.    http://www.micromedex.com/products/demos/webready/Professional/Usp_DI/data_001.html
39.    QUIN, X. Z., IP, D. P., TSAI, E. W.: Determination and rotamer separation of enalapril maleate by capillary electrophoresis. J Chromatogr, A 626, 1992, s. 251 – 258.
40.    QUIN, X. Z., NGUYEN, D. S. T., IP, D. P.: Separation of lisinopril and its RSS diastereoisomer by micellar electrokinetic chromatography. J Liq Chromatogr, 16, 1993, s. 3713 – 3734.

Šramko M., Remko M.
Katedra farmaceutickej chémie, Farmaceutická fakulta UK, Bratislava

STUDY OF ACIDITIES OF SELECTED ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME INHIBITORS

Ab initio density functional theory calculations were used to investigate gas-phase acidities of five selected ACE inhibitors expressed as enthalpy ?H298 and Gibbs energy ?G298 of deprotonation at 298.15 K. This study took advantage of the two layered ONIOM method, which allowed to calculate acidities of selected ACE inhibitors with high accuracy with the Becke3LYP method with 6-311+G(d,p) basis set – the High layer, while the other parts of the molecule were calculated with the Hartree-Fock method with 3-21G* basis set - the Low layer. The investigated ACE inhibitors are weak acids with calculated acidities of about 1290-1420 kJ.mol-1. Of acids studied the highest acidity (in gas-phase and also in water solution) posseses ACE inhibitor spiraprilat.
Key words: acidity – dissociation constant – ACE inhibitors – DFT method – SPARC